华北煤炭医学院学报２０１０年月第１２卷第３期Ｊ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０ Ｍａｙ，１２（３） ・２９７・ Ｎ一硝基一Ｌ一精氨酸甲酯对实验性大鼠隐睾Ｂｃｌ一２表达的影响 谢远杰 石金凤① 赵 李美香 龙治峰① 贺丽萍② （南华大学组织学与胚胎学教研室，①显微形态中心［摘一湖南衡阳４２１００１；②湖南师范大学医学院组织学与胚胎学教研室） 要］ ①目的研究一氧化氮合酶抑制剂Ｎ一硝基一Ｌ一精氨酸甲酯对实验性大鼠隐睾生精细胞凋亡过程中Ｂ细胞淋巴瘤／白血病 ２（Ｂｃｌ一２）表达的影响。②方法４２天龄雄性ｓＤ大鼠建立单侧隐睾模型，随机分为隐睾组、隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组、隐睾＋生理盐水（溶 与假手 媒）组、假手术组，每组１２只大鼠，隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组和隐睾＋生理盐水组大鼠术后分别腹腔内注射Ｌ—ＮＡＭＥ或生理盐水，每天１次，定 时定量（５０ｍｇ／Ｋｇ），术后第７天分别采用ＲＴ—ＰＣＲ和免疫组织化学方法检测各组隐睾Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ和蛋白表达的变化。③结果隐睾＋Ｔ 一ＮＡＭＥ组Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ和蛋白与假手术组睾丸无明显差别。④结论生精细胞凋亡。 术组睾丸相比，隐睾组、 急睾＋生理盐水组睾丸生精上皮和睾丸问质细胞内Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ和蛋白表达降低，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）；而 Ｌ—ＮＡＭＥ可通过调节Ｂｃｌ一２的表达抑制热应激导致的 ［关键词］Ｎ～硝基一Ｌ～精氨酸甲酯隐睾Ｂｃｌ一２ ［中图分类号］ Ｒ ３２９［文献标识码］ Ａ［文章编号］ １００８—６６３３（２０１０）０３—２９７—０３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ—ＮＡＭＥ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ ＡＴＥ ，北，ＳＨＩ Ｊｉ， ｎｇ，ＺＨＡＯ Ｇｕｏｊｕｎ，ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ０，ｏｆＳｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ ４２１００１，Ｃｈｉｎａ） ［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ Ｏｂｊｅｃｆｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ Ｌ—ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｌ—ＮＡＭＥ）ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ４２一ｄａｙ ｏｌｄ ｒａｔｓ ａｎｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｃｒｙｐｔｏｒｅｌｉｆｄｉｓｍ ｇｒｏｕｐ＋Ｌ—ＮＡＭＥ ｇｒｏｕｐ，ｅｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄ— ｉｓｍ＋ｓａｌｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｒｏｇｕｐ（ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ １２ ｃａｓｅｓ）．Ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｔｉｍ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｒｙｐｔｏｒｅｈｉｄｉｓｍ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ａｎｄ Ｌ—ＮＡＭＥＳ０ｍｇ／（Ｋｇ・ｄ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ—．２ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｅｒｙｐｔｏｒｅｈｉｄｉｓｍ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ——ＰＣＲ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅａｌ ＳＡＢＣ ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｔｈｅ ７ｔｈ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｐｅｒ－ ａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ一２ ｉｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ Ｌｅｙｄｉｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄ＋ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｗｈ讧ｅ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄ ｔｅｓｔｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌ—ＮＡＭＥ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｌ—ＮＡＭＥ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｅ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｂｃｌ一２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｒｙｐｔｏｒｅｈｉｄｉｓｍ． ［ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ］ Ｌ—ｎｉｔｏｒａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ．Ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ．Ｂｃｌ一２ 精子发生必须在低于体温２—３℃的环境中进行，长期处于 高温环境工作或先天性隐睾患者都能引起睾丸精子发生障碍并 导致男性不育。睾丸所处环境温度升高不仅能通过氧化应激直 接影响精子发生，还能通过影响凋亡相关基因的表达促使生殖 细胞凋亡。研究表明，热应激导致的生精细胞凋亡增加与一氧 化氮合酶（ｎｉｔｉｒｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）表达增高有密切的关 南农业大学实验动物中心（３５ｄ龄，１１０～１４０ｇ），喂养７天后戊 巴比妥钠（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内注射麻醉，下腹正中切口切断左侧 睾丸引带，随机选取３６只大鼠用５—０尼龙线将左侧睾丸固定 于腹后壁建立左侧隐睾模型，其余１２只将左侧睾丸还纳入阴囊 后关腹作为假手术组。于术后第７天颈动脉放血法处死大鼠， 留取左侧睾丸，每个睾丸切取一半置于液氮罐内保存，另一半置 于多聚甲醛中固定。 系 。过表达ＮＯＳ的转基因大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡率 较野生型大鼠明显提高 。本实验室也证实生精上皮内ＮＯＳ 高表达细胞与凋亡的生精细胞一致－３ｊ。说明ＮＯＳ表达增高是 温度升高促使生殖细胞凋亡的重要分子机制，使用ＮＯＳ抑制剂 １．２试剂Ｂｅｌ一２多克隆抗体及免疫组化ＳＡＢＣ试剂盒均购 自武汉博士德生物工程公司，Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒及Ｂｃｌ一２ 引物均购自上海华美生物工程公司。 减少ＮＯ的产生从而抑制温度升高导致的生精细胞凋亡成为可 能。Ｂｃｌ一２家族蛋白是重要的凋亡相关蛋白，研究表明正常小 １．３ Ｂｃｌ一２蛋白检测常规石蜡切片，免疫组化ＳＡＢＣ法检测 各组大鼠左侧睾丸中Ｂｃｌ一２蛋白的表达，操作方法按试剂说明 鼠睾丸内有较高的Ｂｃｌ一２表达，隐睾内生精细胞凋亡增加，Ｂｃｌ 一进行，阴性对照以ＰＢＳ代替一抗，阳性表达细胞胞质内含棕黄 色颗粒，通过图像分析系统检测阳性细胞的平均灰度值。 １．４ Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ检测 取保存在液氮中的各组睾丸组织 １００ｒａｇ，采用Ｔｒｉｚｏｌ一氯仿抽提总ＲＮＡ，按ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒 （Ｔａｋａｒａ公司）说明合成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增， Ｂｃｌ一２ Ｐｒｉｍｅｒ：ｆｗｄ（ＡＴＡ ＡＧＣ ＴＧＴ ＣＧＣ ＡＧＡ ＧＧＧ）ｒｅｖ（ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＣＴ Ｃ），扩增片段长度为３８２ｂｐ，ＰＣＲ反应 ２表达降低，Ｂｏｘ表达升高 Ｊ。本实验室在证实应用ＮＯＳ抑 制剂Ｌ—ＮＡＭＥ确能抑制隐睾生精细胞凋亡的基础上 ｊ，进一 步研究应用Ｌ—ＮＡＭＥ后实验性大鼠隐睾内凋亡相关基因Ｂｃｌ 一２表达出现的变化，从而揭示Ｌ—ＮＡＭＥ抑制隐睾生精细胞凋 亡的分子机制。 １材料与方法 １．１动物模型的建立及处理４８只健康雄性ＳＤ大鼠购白湖 条件是：９４ｏＣ ４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火６０ｓ，６８℃延伸 ２ｍｉｎ，３５个循环；６８℃延伸７ｍｉｎ。ＧＡＰＤＨ Ｐｒｉｍｅｒ：ｆｗｄ（ＴＣＡ ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＧＡＧ）ｒｅｖ ｆＴＧＴ ＣＧＣ ＴＧＴ ＴＧＡ ＡＧＴ ＣＡＧ 【作者简介】谢远杰（１９７２一），男，硕士，讲师。主要研究方向：生殖生物 学。 ＡＧ），扩增片段长度为６９７ｂｐ，ＰＣＲ反应条件是：９４℃４ｒａｉｎ；９４℃ 变性４５ｓ，５８ｃＣ退火４５ｓ，７２ｃＣ延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２ｏＣ延伸 通讯作者。 ・２９８・ 华北煤炭医学院学报２０１０年月第ｌ２卷第３期３讨论 一Ｊ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０ Ｍａｙ，１２（３） １０ｍｉｎ。反应后取终产物１０ｔｘＬ经１．２％琼脂糖凝胶电泳后，用 凝胶分析系统观察、分析实验结果；测出目的基因及ＧＡＰＤＨ的 氧化氮（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）是ＮＯＳ催化左旋精氨酸（Ｌ— 积分吸光度（Ａ）值，并计算二者的比值，以此比值作为各自ｍＲ． ＮＡ的相对表达量。 Ａｒｇｎｉｎｅ，Ｌ—Ａｒｇ）脱胍基产生的重要的信使分子。研究发现雄 性生殖管道巾广泛存在ＮＯＳ，隐睾、输精管结扎、睾丸扭转及精 索静脉山｛张等病理状态下均可发现生精上皮中ＮＯＳ表达明显 增高，生精细胞凋亡显著增加，提示ＮＯＳ／ＮＯ介导了病理状态 １．５统计学分析采用ＳＰＳＳ １０．０统计学软件对组问均值进 行单因素方差分析，计量资料结果均采用均数±标准差（ｘ± ｓ）表示，Ｐ＜０．０５为差异有显著性意义。 ２结果 下生精细胞的凋亡 。细胞内的分子大都通过蛋白质一 蛋白质的相互影响来发挥作用，这一点ＮＯＳ／ＮＯ应该也不例 外。Ｂｃｌ一２家族蛋白是重要的凋亡相关蛋白，包括促凋亡蛋白 Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄ和凋亡抑制蛋白Ｂｃｌ一２、Ｂｃｌ—ｘｌ、Ｂｃｌ—Ｗ等，凋亡 ２．１ Ｂｃｌ一２蛋白表达假手术组睾丸生精上皮（图１ａ）中生精 细胞排列有序，生精小管内可见到各级生精细胞；隐睾组及隐睾 十生理盐水组均可见到生精小管内生精细胞排列紊乱，生精细 胞与精子的数量减少，可见较多凋亡小体以及多核巨细胞（图 １ｂ，ｃ），隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组睾丸生精上皮（图Ｉｄ）较隐挈组及隐 睾＋生理盐水组厚，可见到少量多核巨细胞。各组睾丸间质细 胞、生精上皮、血管内皮和平滑肌细胞内均有Ｂｃｌ一２表达（图 １）。生精上皮内Ｂｃｌ一２的表达在隐睾组（灰度值１３４．６８±１４．７１） 和隐睾＋生理盐水组（１３０．５０±１２．５５）无明显差异，但弱于假手 术组（１１８．９２±８．５９）和隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组（１１５．３１±１３．５１）。 图１ 免疫组化ＳＡＢＣ法检测各组大鼠左侧睾丸Ｂｅｌ一２的表达ｆ４００×） ａ假手术组ｂ隐睾组ｃ隐睾＋生理盐水组ｄ隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组 ２．２ Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ量的变化如图２所示，隐睾组（相对值 ０．０８ ４－０．０１）和隐睾＋生理盐水组（０．０８ ４－０．０１）睾丸内Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ量明显低于假手术组（０．５０ ４－０．０４）和隐睾＋Ｌ～ＮＡＭＥ 组（０．５２ －４０．０７），隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组与假手术组之间睾丸内 Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ量差别没有显著性意义。 ｆ Ｇ９７ｂｏ Ｂｃ１—２ ３８２ｂｐ 图２各组大鼠左侧睾丸Ｂｃｌ一２ ｍＲＮＡ相对量的变化 Ｍ—Ｍａｒｋｅｒ １一假手术组２一隐睾组３一隐睾＋生理盐水组 ４一隐睾＋Ｌ—ＮＡＭＥ组 抑制蛋白通过与Ｂｃｌ一２家族的促凋亡蛋白形成异二聚体，从而 维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布，减弱了Ｂａｘ—Ｂａｘ同源 二聚体诱导凋亡的作用，Ｂｃｌ一２和Ｂｃｌ—ｘｌ还能阻止胞膜脂质 过氧化，抑制线粒体细胞色素Ｃ释放，使细胞色素Ｃ无法达到 激活下游胱解酶的阈值，抑制细胞凋亡。研究表明Ｂｃｌ一２家族 蛋白对生精细胞凋亡有重要的作用 ］，睾丸局部温度升高 可通过丝氨酸的磷酸化使Ｂｃｌ一２失活，并通过活化ＭＡＰＫ１４介 导的线粒体依赖途径促使生精细胞凋亡 ］；正常小鼠睾丸内有 较高的Ｂｃｌ一２表达，隐睾内生精细胞凋亡增加，Ｂｃｌ一２表达降 低，Ｂａｘ表达升高 Ｊ。本实验通过ＲＴ—ＰＣＲ及免疫组化检测证 实隐睾内Ｂｃｌ一２在ｍＲＮＡ水平及蛋白表达上均低于假手术组。 研究发现，在支气管黏膜上皮中ＮＯ能通过激活ＭＡＰＫ这一信 号途径来Ｂｃｌ一２家族蛋白的表达影响细胞凋亡 ，但至今 为止，对睾丸内ＮＯ的作用蛋白还未见报道。本实验室前期的 研究结果表明ＮＯＳ抑制剂Ｌ—ＮＡＭＥ确能抑制隐睾生精细胞凋 亡，本研究通过ＲＴ—ＰＣＲ及免疫组化检测发现给予适量的Ｌ— ＮＡＭＥ后，隐睾生精上皮和间质细胞内Ｂｃｌ一２表达明显升高， 与假手术组无明显差异，表明Ｌ—ＮＡＭＥ能通过促进隐睾内Ｂｃｌ 一２的表达，从而抑制隐睾导致的生精细胞凋亡。由于细胞凋 亡的是一个复杂的网络系统，对于Ｌ—ＮＡＭＥ是否也是通 过ＭＡＰＫ信号途径调节ｂｃｌ一２的表达从而抑制生精细胞凋亡 尚需进一步研究。 参考文献 ［１］Ｇｕｏ Ｊ，Ｊｉａ Ｙ，Ｔａｏ ＳＸ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＮｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｕｒ－ ｉｎｇ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｔｅｓｔｓ ｏｆ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ａｆｔｅｒ Ｔｅｓｔｏｓ－ ｔｅｒｏｎｅ ａｎｄ Ｈｅａｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｊ Ａｎｄｒｅｌ，２００９，３０（２）：１９０ ［２］ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ，Ｇｏｄａ Ｋ。ｅｔ ａ１．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｒｙｐｔｏｒｅｈｉｄｉｓｍ［Ｊ］．Ｊ Ａｎｄｒｏｌ， ２００５，２６（２）：２８１ ［３］ 谢远杰，石金凤，赵，等．实验性大鼠隐睾中ｅＮＯＳ的表达与生 精细胞凋亡［Ｊ］．华ｊＥ煤炭医学院学报，２００９，１１（５）：６１７ ［４］ 徐健，许增禄，钱晓青，等．Ｂｃｌ一２基因在小鼠睾丸及试验隐睾 巾表达的研究［Ｊ］．解剖学报，２００１，３２（１）：４７ 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Ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｉｌ￣ｔａｈｍａ［Ｊ］．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３， ＩＩ２（４）：７６１ ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００７，７７（１）：８３ （２０１０—０２—０８收稿）（岳静玲编辑） 益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的调节作用 刘会茹 孙 影 张雪鹏① 杨 方 河北唐山０６３０００） （华北煤炭医学院实验中心，①附属医院［摘要］①目的观察自拟中药复方益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞（ｇｌｏｍｅｍｌ￣ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ，ＧＭＣ）分泌细胞外基质的抑制作用。② １０％血清促进了 益 方法将１ ｘ １０～、１ ｘ １０ 和１×】０Ｉ１ｍｇ／ｍＬ益肾蠲湿合荆的提取液作用于舍１０％血清ＤＭＥＭ培养的ＧＭＣ，分别于２４、４８和７２ｈ后收集 培养上清，采用Ｅｌｉｓａ法检测上清中透明质酸（ｈｙａｌｕｍｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＡ）、纤维连结蛋白（ＦＮ）及Ⅳ型胶原（ＣｏｌＩＶ）含量。③结果肾蠲湿合荆可以抑制体外培养的ＧＭＣ分泌ＨＡ、ＦＮ和ＣｏｌｌＶ，推测这种作用是其治疗慢性肾小球疾病的主要机制之一。 ［关键词］ 益肾蠲湿合荆 肾小球系膜细胞 系膜外基质 ＧＭＣ分泌ＨＡ、ＦＮ和ＣｏｌＩＶ，但这种作用可明显被不同浓度的益肾蠲湿合剂所抑制，并且其抑制程度随药物浓度的增加而增加。④结论［中图分类号］Ｒ ２８５．５［文献标识码］Ａ【文章编号］１００８—６６３３（２０１０）０３—２９９—０２ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ ｍａｔｒｉｘ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅ－ ｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌｓ ＬｌＵ Ｈｕｉｒｕ ｓＵＮ Ｙｉｎｇ，ｚＨＡＮＧ Ｘｗｅｐｅｎｇ。ｅｔ ａｌｔＮｏａｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｎｇｓｈａｎ ０６３０００，Ｃｈｉａ）ｎ ［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅ：ｒｂｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａ－ ｃｅＨｕａｒ ｍａｔｒｉｘ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｇｌｏｍｅｍｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｎｓ（ＧＭＣｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＧＭＣｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ １０％ｓｅｒｕｍ—ＤＭＥＭ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌ ×１０～，１ ｘ １０ ａｎｄ １ ｘ ｌ０ ｍ ｍＬ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂｓ ｆｏｒ ２４，４８ ａｎｄ ７２ ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｍａｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＡ），ｆｉｂｒｏｎｅｅｔｉｎ（ＦＮ）ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ（ＣｏｌＩＶ）ｕｓｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｅ ＳｅＣＩ￣－ ｔｉｏｎ ｏｆ ＨＡ，ＦＮ ａｎｄ Ｃ０ｌⅣｉｎ ＧＭＣｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ １０％ｓｅｒｕｍ．ｗｈｉｌｅ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ．ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｌｉｆｂｉｔｏｒｙ ｄｅｇｒｅｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆ ｏＨＡ，ＦＮ ａｎｄ ＣｏｌⅣｉｎ ＧＭＣｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈ．ｗｈｉｃｈ ｉｎｖｌｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ”Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ”ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌ－ ｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｍｅｍ１ｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ． ＩＫＥＹ ＷＯＲＤＳ １ Ｙｉｓｈｅｎｊｕａｎｓｈｉ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂｓ．Ｇｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ；Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ 自拟中药复方益肾蠲湿合剂是华北煤炭医学院教授在 总结多年诊治经验的基础上，拟定的治疗多种慢性肾小球疾病 ４８ｈ。浓缩、干燥后得到中药总提物。加人ＤＭＳＯ制成储存浓度 为１０ｍｇ／ｍＬ的中药提取液（每ｍＬ制剂中含中药提取物ｌＯｍｇ）， 的基本方药，经临床证实效果良好的 。肾小球系膜细胞 经０．２ｉｘｍ滤膜过滤除菌，一２ＯｃＣ保存备用。 （ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉｌａ ｃｅｌｌ，ＧＭＣ）的过度增殖及系膜基质的积聚 是导致多种慢性肾小球疾病的重要原因之一∽Ｊ。已证实本复 １．２．２细胞上清液的制备。ＧＭＣ达到７０％融合后，吸弃上清 液，每￣Ｌ（９６孔板）加入无血清培养液２００ｉｘＬ培养４８ｈ，使绝大 部分细胞处于同步（ＧＯ期）。弃上清后分别加入ＤＭＥＭ培养液 （１６０ｉｘＬ）、血清（２０ｉｘＬ）及低、中、高剂量的含药血清（２０ｉｘＬ），每 组设５个复孑Ｌ，分别于培养２４、４８和７２ｈ时吸取弃各孔培养液， ７０℃保存。 １．２．３细胞培养液中ＨＡ、ＦＮ及ＣｏｌＩＶ的检测。采用酶联免疫 一方具有抑制ＧＭＣ增殖的作用。本研究将观察对ＧＭＣ分泌透明 质酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｅ ａｃｉｄ，ＨＡ）、纤维连结蛋白（ＦＮ）及Ⅳ型胶原（Ｃｏｌ Ⅳ）含量的影响，从细胞和分子生物学方面进一步探讨其作用 机制。 １材料与方法 １．１材料①益肾蠲湿合剂水煎液 由华北煤炭医学院【１ｔ西 吸附法（ＥＬＩＳＡ）。９６孔培养板中每孔分别加入经包被缓冲液稀 释的抗ＨＡ、ＦＮ及ＣｏｌＩＶ的抗体５０１ｒＬ（１Ｏｍｇ／Ｌ），４￣Ｃ静置过夜； 蒸馏水洗孔，加入含１％ＢＳＡ的封闭液，３７℃封闭３０ｒａｉｎ；甩去后 加入５０ 待测样品，２ｈ后洗孔，加入ＨＲＰ标记的ＩＩ抗，再培养 医结合医院提供。②细胞。大鼠肾小球系膜细胞（ＨＢＺＹ—１） 由武汉大学中围典型培养物保藏中心提供。③仪器及试剂。透 明质酸（ＨＡ）Ｅｌｉｓａ试剂盒购自上海史瑞可生物科技有限公司： 纤维连结蛋白（ＦＮ）及Ⅳ型胶原（ＣｏｌⅣ）购自武汉博士德生物公 司。 １．２方法 ２ｈ；洗孔后加入１００ｉｘＬ ＯＰＤ显色，每孑Ｌ加入２ｍｏｌ／Ｌ的硫酸以中 止反应，用ＥＬＩＳＡ仪读取４９０ｎｍ波长各孔的光密度值。 １．３统计学处理用ＳＡＳ软件进行统计处理。所有数值以均 数±标准差表示，两样本间均数的比较采用ｔ检验。Ｐ＜Ｏ．０５为 １．２．Ｉ“益肾蠲湿合剂”的提取液的制备。中药复方按各味药 的比例总量取１００ｇ，加入７０％的乙醇溶液１ ０００ｍＬ室温提取 【基金项目】本课题受唐山市科技局资助（０４３６２００１Ｂ—ｌ２）。 作者工作单位：河北科技师范学院校医院。 差异显著，Ｐ＜０．Ｏｌ为差异极显著。 ２结果 ２．１益肾蠲湿合剂对ＧＭＣ分泌ＨＡ的影响 由表１看出，低、 中、高剂量的益肾蠲湿合剂不同程度地抑 了ＧＭＣ分泌ＨＡ，
