第九章 发育毒性与致畸作用hyn

第一节 概 述

 发育毒性(developmental toxicity)

指出生前接触某些环境因子对从胚胎或胎仔发育到出生后青春期前的子代造

成的有害作用，包括发育生物体死亡、结构异常、生长迟缓、功能缺陷。 ◆发育毒理学（developmental toxicology）：研究出生前暴露于环境有

害因子导致的异常发育结局及其作用机制、发生原理、影响因素、毒物动力学及其评价的科学。

畸胎学（teratology）

现代实验畸胎学（19世纪初）

历史的教训

 1940年澳大利亚风疹大流行，次年流行婴儿先天性白内障、耳聋、智力不全、先天性心脏病  1945年广岛长崎原子弹爆炸，受辐射儿童小头畸形、智力低下，一年内死亡率25%  1960年反应停事件（thalidomide incident）， 欧洲出生8000多海豹畸形或海豹症（phocomelus）

儿童

 1968年日本多氯联苯污染米糠油事件，孕妇出现死产、早产、¡°油症儿¡±

 1961~1970年美国在越战中使用落叶剂2,4,5-T（含TCDD），孕妇流产、产下小头和Down¡¯s综合

征畸形儿

 1966~1972年美国孕妇服用己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES），300多少女发生阴道癌

反应停（沙利度胺）事件

 孕妇的理想选择？

 1953年，联邦德国一家名为Chemie Gruenenthal 的制药公司研究人员发现，反应停具有一定的镇静安眠作用，而且对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳。

 1957.10.1该公司将反应停正式推向市场

令人恐怖的副作用

 到1960年，欧洲医生开始发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升：四肢畸形（主要是双

上肢短肢畸形）、腭裂、盲儿、聋哑儿、内脏畸形等

 截至1963年在世界各地，如西德、美国、荷兰和日本等国，由于服用该药物而诞生了12000

多名这种形状如海豹一样的可怜的婴儿。

 经过调查证实，母亲从停止月经算起，34－54天之内，服用此药后，迟早会出现各种不同

的症状。

第二节 发育毒性与致畸性

一、基本概念

发育毒性:出生前经父体或（和）母体接触外源性理化因素，引起在子代到达成体之前这段时间内出现的有害作用。

发育毒性具体表现

 生长改变：一般指生长迟缓，胚胎与胎儿发育在外来化合物的影响下，较正常

的发育过程缓慢。

 结构异常：由于外来化合物的干扰，胎儿在出生时表现出形态结构异常，即畸

形。

 功能缺陷：胎儿的生理、生化、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。  发育生物体死亡：由于外来化合物的作用，在胚胎或胎儿发育期间对胚胎或胎

儿产生损害，并致其死亡，具体表现为自然流产、死产，死胎率增加。

 畸形：在胚胎发育过程中，由于受到各种理化因素的影响，使胚胎细胞的分化、

器官形成和发育不能正常进行，以致出现器官的器质性缺陷，造成形态结构的异常（狭义）。分为严重畸形和轻微畸形。广义的畸形还包括生理、生化以及精神（行为）发育缺陷。

 致畸性和致畸作用：在妊娠期接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或

作用。

 致畸物（致畸原）：凡是能透过母体的胎盘屏障，直接作用于胚胎细胞，引起

胚胎发育障碍，导致先天性畸形的外来物，称为致畸物或致畸原。

➢不良妊娠结局：妊娠后不能产生外观和功能正常的子代。包括所有的不良

结果，如流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。

二、发育各阶段生殖毒性作用特点 着床前期发育毒性

 从受精算起，到完成着床前（人类为11-12天、啮齿类动物为前6天）

 通常是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡，即着床前丢失

 也有着床前接触毒物导致畸形的例子：环氧己烷、甲基亚硝脲等

器官形成期（胚体发育期）

 着床-硬腭闭合

 自受精日计算：人3-8周；大鼠约9-17天；小鼠约7.5-16天；家兔6-18天

 在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期（critical period）

至第八周末——

 在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常；也有可能发生胚胎死亡、生长迟缓；

 发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间，即“靶窗（target window）”

 大鼠器官发生期为受精后9-17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9-10天 大鼠胚胎各器官的特殊敏感期

 同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形

 如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂

胎儿期

 器官形成结束后（以硬颚闭合为标志）即进入胎儿期（人类从56-58天起），直到分娩  特点：

◇ 以组织分化、生长和生理学的成熟为主。

◇ 最易表现的发育毒性是生长迟缓、特异的功能障碍（神经、内分泌及免疫系统机能的改变）、经胎盘致癌和偶见死胎

◇ 胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽然较胚体低，但仍有一定数目的死产胎发生

围生期和出生后的发育期

一些功能方面的缺陷出生时不易发现，需要出生后继续观察，研究较多的是

 发育免疫毒性

 神经行为发育异常  儿童期肿瘤

特点

 机体不同系统和器官的形成与发育不完全同步；分娩时多数器官胎儿期发育成熟，但神经系统、生殖系统直到儿童期、少年期、成熟期才告完成。

 不同化学毒物作用于不同发育阶段，产生不同效应。  最容易引起畸形的阶段是器官形成期

（二）、发育毒性的剂量-反应模式

和阈值

（二）发育毒性的剂量反应关系模式：

发育毒性是否有阈值尚存在争论

 很难用实验找出一个发生率很低的剂量-反应关系，因为那需要极大的样本数量，如每剂量组几百到几千窝的动物

 多数发育毒性机制还不了解，有的已知机制支持阈值的存在，而有些机制则不支持

 通常认为哺乳动物的发育毒性是一种有阈剂量的效应

◆ 致畸带：从NOAEL到胚胎死亡剂量之间的范围，致畸带越宽，该物质的致畸危险性越大

 致畸的物种个体差异：

 任何环境有害因素的损害效应都存在物种品系及个体差异，在致

畸作用中较突出。例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家免和仓鼠并不致畸。农药敌枯双对大鼠致畸作用明显，但未得到人群调查的证实资料。同一物种不同品系对一种致畸物敏感性

的差别很大，反应停和脱氢皮质酮都有这种现象。

 可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异；也可能由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎，而不同物种动物胎盘构造也不相同。这些差异可能是由于遗传因素，即基因型差异。

三、母体毒性与发育毒性

母体毒性作用可分为

 遗传学：如腭裂的发生率依赖于母体的而非婴儿的基因型，白人中的发病率比黑人更高

 疾病：母体未控制的糖尿病、某些感染，经过间接的疾病相关的母体变化或直接经胎盘的感染对孕体有不利的影响  营养  应激

 对胎盘的影响

母体毒性与胚胎毒性的关系

 1.具有致畸作用，但无母体毒性出现，称为非共效应致畸物（non-coeffective teratogen）

√此类外源化学物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关，如反应停

√此类外源化学物的致畸作用往往较强，最容易被忽视也最危险，应特别注意

 2.出现致畸作用的同时也表现母体毒性，称为共效应致畸物（coeffective teratogen）

√此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者无直接联系，可能是继发效应。  3.仅具有母体毒性，但不具有致畸作用

4.在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现胚胎毒性

 发育毒性是否由母体毒性导致的？

 明确有发育毒性的有害因素同时也有母体毒性；  发育毒性的严重程度和发生率与母体毒性相关。

四、父源性发育毒性

 通过父亲对发育个体产生不良影响--父源性出生缺陷、流产、死胎、儿童肿瘤、出生性别比改变…

 某些出生缺陷与父亲的遗传、年龄和暴露因素等有关，被称作为父源性出生缺陷（paternal birth defect）

化学物致畸力（ILSI）

（一）乙醇与吸烟 （二）乙烯雌酚 （三）甲基汞 （四）铅

 可影响心脏、骨骼、小肠、肾、生殖系统和神经系统，儿童中枢神经系统对铅非常敏感。

 铅可造成儿童智商明显降低、注意力缺陷多动障碍、阅读和学习能力显著减弱。

（四）视黄酸

 视黄酸是具有维生素A结构或与其功能相似的天然或人工合成的化合物。

 致畸活性由多种受体及其配体介导

——视黄酸受体（RAR)

服用过量维生素引起畸形

第三节 致畸（发育毒性）作用机制

（Mechanisms of Teratogenic Action）

 哺乳动物正常发育的分子机制尚不清楚  原因不清楚

出生缺陷：15%-25%遗传因素

4%母体状况 3%母体感染

1%-2%脐带阻断等宫内机械性问题 1%有明确化学物或其他环境因素 65%未知病因

Wilson致畸学基本原理（1973）

 对致畸的易感性依赖于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式

 对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期不同而变化  致畸物以特定方式作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件  对发育组织的有害影响依赖于有害因素的性质

 异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷

 随着剂量增加，异常发育表型的频率和程度增加，从无作用到全部致死水平

 Wilson(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。

可能机制

 干扰基因表达

 基因突变与染色体畸变

自发流产的胚胎中至少50％存在染色体畸变（主要是不分离 ）

 细胞损伤和死亡

 干扰细胞-细胞交互作用  通过胎盘毒性引起发育毒性

 干扰母体稳态

 发育免疫毒性机制  发育神经毒性机制

一、基因突变与染色体畸变

 环磷酰胺（Cyclophosphamide,CP)

 可诱发DNA断裂和染色体畸变，同时也被用作致畸试验的阳性物，可引起脑积水、露眼、腭裂、小颌畸形、脐疝、尾部和肢体畸形等。

 染色体畸变占人类发育缺陷原因的3%，自发流产至少有50%存在染色体畸变。

二、干扰基因表达

 在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形

 剔除Wnt-1基因的突变小鼠也可产生中脑和后脑的畸形

 向小鼠胚胎中加入鸡的-肌动蛋白启动子时，Hox-1.1基因表达，并产生多种颅脸部和颈椎的畸形。

二、干扰基因表达

 表观遗传学（Epigenetics） —DNA甲基化 —组蛋白修饰 —染色质重塑 —microRNA

三、细胞损伤与死亡

 诱发细胞凋亡，干扰正常发育，引起胚胎畸形—沙利度胺、全反式视黄醇、N-乙酸基-2-乙酰氨基芴、甲基汞、乙醇等  导致细胞周期混乱—氧化损伤和DNA断裂

四、干扰细胞-细胞交互作用

 细胞-细胞间的相互作用主要通过细胞通讯来实现，包括缝隙连接通讯、膜表面分析接触通讯等直接的细胞间通讯和由受体介导的细胞信号转导系统。

细胞间的通讯方式

 GJIC参与细胞的分化生长与发育

——胚胎期8细胞桑葚胚期，细胞间均有缝隙连接；抑制GJIC则可导致细胞异常形态。 五、通过胎盘毒性引起发育毒性

 镉在妊娠中晚期可致胎盘坏死或血流减少；  抑制对营养物质的传送

六、干扰母体稳定

第四节

发育毒性和致畸作用试验与评价

 哺乳动物发育毒性试验  人群流行病学调查  发育毒性替代试验

 化学物理化特性：构效分析

动物发育毒性试验

对一新的化学毒物或产品，不应直接对人做临床研究，也不

可能进行流行病学研究，首先靠动物实验来预测其生殖和发育毒性，迄今为止认为用动物试验预测化学毒物对人类的致畸性，灵敏度较高。

动 物 发 育 毒 性 试 验

优点：

育毒性。

容易控制接触条件、接触动物数量、年龄、状态及选择检测效应指标（终点）。

甚至一些轻微的效应对研究人体影响很有意义。预测新的化学物或产品的生殖发

缺点：

结果外推到人（暴露剂量较低）有一定困难，况且人与人之间的个体差异要比动物的更大。费时、费钱，很难满足对大量投放市场的化学物进行生殖与发育毒性评价

试验结果外推到人存在不肯定性，预测对人的致畸性特异性不够高；从较高剂量暴露

的需要。

动 物 发 育 毒 性 试 验

评价生殖发育毒性的方案应连续通过一个完整的生命周期，即

从亲代受孕到子一代性成熟，以较全面的反映接触有害因素所致的即发和迟发生殖、发育效应（近、远期效应)。

一、哺乳动物发育毒性试验

生 殖 发 育 过 程

一、生育力和早期胚胎发育毒性试验

 1、研究目的 评价化合物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床前和着床的影响。雌性包括对动情期、输卵管运输、着床和胚胎着床前阶段发育的影响。雄性包括检测对功能的影响（包括性欲、附睾精子成熟等）

 2、动物 至少一种，首选大鼠。每性别、每组16-20窝。

 3、给药期 一般采取雄性交配前4周开始染毒，直至交配成功。雌鼠交配前2周开始染毒（可覆盖至少两个完整的动情期）直至着床。

 4、交配及受孕检查 交配期2~3周，比例1:1。

 5、终末处死 雌鼠在孕中期13-15天终止妊娠。雄性在证实交配并受孕成功后处死。

 6、观察项目 染毒期间观察雌雄亲代（F0)的体征和死亡（至少1次/日），体重（至少2次/周），摄食（1次/周），镜检雌性阴道涂片和其他毒性研究中见到的靶效应。

所有动物的生殖系统做组织病理学。附睾或睾丸中精子计数以及精子存活力测定。计数雌性黄体数，着床数。吸收胎，死胎和活胎数。对明显未孕的大小鼠，可硫化铵鉴别胚胎着床前死亡。

（二）胚胎-胎体毒性试验（致畸试验）

 致畸作用是发育毒性中最重要、最容易观察到一种表现，故化学物发育毒性的评定主要通过致畸试验。

 在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。

 传统常规致畸试验即第Ⅱ段试验是评定化学物是否具有致畸作用的标准方法。

胎体检查  以上检查只能检出结构与形态的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。

 故为了全面了解可能存在的先天缺陷和生理功能异常，可将试验雌鼠保留1/4左右待其自然分娩，饲养观察出生幼仔以便检查。

（二）胚胎-胎体毒性试验（致畸试验）

致畸试验影响因素 1、致畸敏感性

 整个器官形成期染毒有时可导致多数的胚胎死亡，活胎不多，致畸作用和生长迟缓作用不易显示。因此在胚胎死亡特别多，补做单天染毒的试验。

 器官形成期前的染毒 传统致畸试验为阴性，致突变性为阳性。为确保安全，补做器官形成期之前的染毒，如交配后5小时和25小时期至器官形成期前止染毒。

2、物种差异 两个物种

3、化学物的剂量

应包括有致轻度母体毒性的剂量

4、调整合笼时间以达到准确观察生长迟缓。

5、其他因素 理化和染毒途径（反应停，苯菌灵，EDTA）

三、出生前和出生后发育毒性试验 （围生期毒性试验）

1、研究目的 评价母体自着床至断乳期间接触化学物对妊娠/哺乳母体和对孕体及子代发育直至成熟的有害影响。在此期间引起的毒性反应会延迟发生，故观察应继续到性成熟。有害影响主要包括增加与未妊娠雌性有关的毒性，子代出生前和出生后死亡，生长与发育的改变，子代中的功能缺陷（包括行为，青春期性成熟）和生殖（F1代）。

2、动物 大鼠，每组16~20窝。 3、染毒期 雌性从着床至哺乳期终止。

4、实验程序及终末处死 允许分娩和抚养子代到断乳。亲代于F1代断乳时处死。子代出生当天被定为出生后0天。在断乳时，陆续被处死至每窝可选出8只雌雄，评价生殖能力的F1代要在雌雄同笼，子二代F2代出生后处死。

5、观察项目

 染毒期间观察亲代体征和死亡（至少1次/日）、体重、体重增长（至少2次/周）和在以前毒性研究中见到的有评价价值的靶效应、妊娠的长度、分娩。

 处死动物全部尸解，生殖系统病检。检查着床腺。

 子代需检查每窝出生时活仔数、死仔数、畸形数、出生时和断乳前后存活率、体重、身长、身体发育、性成熟和生育力、感觉功能反射和行为等。

动物胚胎对人致畸物的反应

动物发育毒性试验－－三段生殖毒性试验

生殖毒性的评价

两代一窝(和一代一窝)生殖试验

生殖毒性的评价

 试验方案 :  三代两窝

二、流行病学研究和人类的证据

 人类证据的获得

病例报告、出生缺陷登记

回顾性或横断面调查：需要正确发现结局和相关暴露，需要足够大的效应和研

究人群  目的：

(1)寻找导致出生缺陷的原因；

(2)通过监测了解出生缺陷的发生趋势； (3)引起公众关注，保护公众健康；

发育流行病学面临的问题:

 1. 庞大的样本量

 2.出生缺陷发病率和患病率的区别，前者的分母是所有妊娠数后者是出生活胎数

 3.研究的同质性：同一种结局，着眼点的不同，收集资料的方向就不同

 4.资料收集的标准和准确性以及可靠性

 5 .混杂因素：年龄、孕产次、生活方式，饮食习惯等

（二）人类发育毒物的确定

 人类发育毒物的确定

主要依据：流行病学研究、有控制的临床研究结果

经证实可以引起人类发育异常的致畸原只有40种左右  确认人类致畸物的标准：

(1)一种特殊的缺陷或几种缺陷并发(综合征)的频率突然增加。

(2)缺陷的增加与某种已知的环境改变(如一种新药的广泛使用)相关联。

(3)在妊娠的特殊阶段已知暴露于某种环境的改变，产生有特征性缺陷的综合征。 (4)缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿的其他共同的因子。

（三）致畸物及发育毒物的危险性分类

三、发育毒性的初筛和替代试验

 体外预筛试验

√由于删除了母体毒物动力学、生物转化、以及胎盘屏障的影响，可靠性受到一定怀疑；但对于不存在母体毒性的致畸物，可靠性稍高

√对发现致畸作用的靶器官或阐明致畸作用方式与机制，比传统致畸试验有优势

√常见：全胚培养、器官培养、细胞培养

大鼠全胚胎培养、胚胎细胞微团培养、小鼠胚胎干细胞试验

大鼠全胚胎培养

 自从１９７８年首次在体外进行啮齿类动物全胚胎培养成功后，这一技术逐渐被应用于毒理学研究。

 用于着床后全胚胎培养的胚体正处于器官发生期，是对有毒外源物高度敏感的发育阶段，能较好的反映化学物对胚体的影响。  该方法在毒理学、药理学等领域被广泛应用，但本法技术难度相对较大，费用高。

大鼠全胚胎培养

 具体试验方法；从孕期９～１０天大鼠子宫取出胚体，剥去Reichert膜，放入加有外源化学物的培养液中，在孵箱中通气旋转培养．

 观察心脏搏动、卵黄囊直径、胚芽、神经管闭合、体节数目及体长等发育情况。根据Brown评分对器官形态分化做出评价。  可筛试化学物的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制。

细胞培养

细胞微团培养 胚胎干细胞试验

细胞微团培养

 从第11天的大鼠胚体取出达标CNS的原代中脑细胞微团、肢芽区或其他区的细

胞微团，置于含有不同浓度受试物的培养瓶中共同培养5天  用中性红染色判断细胞存活，苏木精染色判断CNS化数量，用Alcian蓝染色判断

肢芽软骨细胞分化数量。

 通过比较受试物组与对照组数据，评价化学物的发育毒性。

胚胎干细胞（ESC）试验

 ESC是一种具有发育全能型的细胞，一般从哺乳动物的囊胚内细胞群分离培养

而来。

 适当条件下，ESC可被诱导分化为多种组织、细胞。

 最早建立的ESC株来源于小鼠，此后的20多年里相继建立了猪、牛、兔、灵长

类动物的ESC。

胚胎干细胞（ESC）试验

 由于ESC提供了在细胞核分子水平上研究胚体发育过程中早期事件的良好材料，在发育毒理学、药物开发领域的前景非常广阔。

 Laschinski等研究了几种化学物对ESC的毒性效应，发现ESC对致畸物的敏感性比培养的纤维细胞高。

 此外，ESC在发育毒理学的应用，可避免物种差异，至少部分解决了实验动物结果外推于人的难题。

 体内初筛试验（C/K试验）

√1982年由Chernoff和Kavlock 改进后获得较大的接受度，故又称为C/K试验。 √ 1995年列入OECD化学品测试准则，推荐用大鼠。

√原理:大多数出生前受到的损害将在出生后表现为存活力下降和（或）生长障碍，

因此在仔鼠出生后，观察其外观畸形、胚胎死亡、生长迟缓等发育毒性表现，而不进行常规试验中内脏和骨骼检查，就可以达到初筛目的。 √该法使用的动物数少，检测终点少，实验周期短，能提供有关化学物对生殖和（或）

发育可能产生影响的初步信息，已有效地用于化学物的初筛。

发育神经毒性测定

 经典的啮齿类动物  替代试验：

体外模型：永生化细胞系包括啮齿类动物及人类神经瘤细胞系，常见的啮齿

类动物细胞系包括PC12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)、B50(大鼠神经细胞瘤)等；原代神经细胞培养；神经干细胞；聚集脑细胞培养；器官型培养 非哺乳动物整体模型：斑马鱼、线虫等