维普资讯 http://www.cqvip.com 。。 Ｖ—ｏ。卷舅２崩中国组织工程研究与临床康复舅０２ ａｔｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃ ｈ Ｍａｙ２ ００ ７１． １ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔｖｅＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉ，Ｉ７２， Ｎ。ｏ ２Ｊ援０ 基础医学 层黏连蛋白与脑微血管内皮细胞对共同植入缺血模型大鼠脑内 神经干细胞增殖与凋亡的调节 张晓梅，王玉琳，朱晓峰 ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｅｕｒ０ｓｄｅｎｃｅ．Ｊｉａｍｕｓｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉ ｕａｍｓｉ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏ－ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ １５４００７，Ｈｅｉｌ。ｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎ￣ｉ Ｚｈａｎｇ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ， Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｃｈｉｅｆ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．１ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊｉａｍｕｓｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｊｉａｍｕｓｉ １５４００７，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎ８ ￣ｋｘ２７２７＠１６３．Ｇｅｍ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ：ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｕｎｄａＵｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．Ｎｏ ３０４５００６２ ： ｔｈｅ ＮａｔｕｒａＩ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｅｉｌｏｎｇＪｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ＮＯ．ＺＪＹ０５０８ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ－２ｏ０７＿ｏ１—１８ Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２００７－０４－０５ 佳木斯大学神经科 学研究所，黑龙江省 佳木斯市１５４００７ 张晓梅，女．１ｇＢ９年 生，黑龙江省克东县 人，汉族．１９９３年黑 龙江中医药大学毕 业。副主任医师．主 要从事神经干细胞 基础与应用研究。 ￣ｋｘ２７２７＠１６３．Ｇｅｍ 国家自然基金项目 （批准号３０４５００ ６２） ，黑龙江省自然 基金重点项目（批准 号 Ｙ０５０８） 中圈分类号：Ｒ３９４．２ 文越标识码：Ａ 文章编号：１６７３．８２２５ （２００７ ）２０－０３９６０－０４ 收稿日期：２００７－０１・１８ 修目日期：２００７．０４－０５ （０７－５０－１－４０１／ＧＷ・Ｑ） ３９６０ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａｎ ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｉａｍｉｎｉｎ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａＩ ｃｅｌｌｓ（ＶＥＣｓ）ｗｅｒｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｃｅｒｅｂｒｕｍｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｄｅＩ ｒａｔｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｅｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｏｄｙ． ＭＥＴＨｏＤＳ：Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｍｕｓｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｊａｎｕａｒｙ ｔｏ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １ ９９６．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｍａｌｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｏｆ ３００— ３５０ ｇ． ６ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ａｇｅ． ｗａｓ ｐｕｒｃｈａｓｅｄ ｆｒ０ｍ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＡｎｉｍａＩ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈａｒｂｉｎ ＭｅｄｉｃａＩ Ｃｏｌｌｅｇｅ． ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：（１）Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｎｅｗｂｏｒｎ ｗｉｔｈｉｎ ２４ ｈｏｕｒｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ． （２）Ａｆｔｅｒ ｂｒａｉｎ ＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ，ＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｓｅｅｄｅｄ ａｔ ａ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ３ｘｌ０ Ｌ－’ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ．Ａｆｔｅｒ １２ ｈｏｕｒｓ， ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｓｕｃｋｅｄ．ａｎｄ ｂｒａｉｎ ＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｓｍｅａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｉａｍｉｎｉｎ．ｔｈｅｎ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｔ ａ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ６ｘ１Ｏ０ Ｌ－’ｗａｓ ｐｕｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ． ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ａｄｄｅｄ． Ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｓｉｘ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ．ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ａｄｈｅｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｗａｌ１ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｍｅａｒｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｉｎ Ｉａｙｅｒ ｏｆ Ｉａｍｉｎｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｂｒａｉｎ ＶＥＣｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ｖａｃｃｉｎａｔｄｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ａｄｄｅｄ．１２—２４ ｈ０ｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅ．ＶＥＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ．（３）Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｄｅ． Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏＢｏｗｓ： ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａＩ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｗｉｔｈ Ｉｅｓｓ ｔｈａｎ ２ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ． ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ． ｎｏ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ａｎｄ ｒａｔｓ ｄｉｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｏｔａｌｌｙ ４８ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌ Ｉｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ２４ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ４ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ，ｎａｍｅｌｙ ３，７，１４ ａｎｄ ６０ ｄａｙｓ ｗｉｔｈ ６ ｒａｔｓ ａｔ ｅａｃｈ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ．３ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｍｏｄｅｌｓ， ｔｈｅ ｒａｔｓ ｉｎ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ｇｒｏｕｐ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒａｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｇｒｏｕｐ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｔａｒｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．ｅａｃｈ ５ ｐ．Ｌ．ＮｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ Ｉａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｒｄｕ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｆ０ｒ ３ ｄａｙｓ ｂｅｆｏｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ＰＢＳ．ＣｅｌＩ ｄｅｎｓｉｔｙ ｗａｓ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｉｎｔｏ ２ｘｌ０”Ｌ．Ｒｉｇｈｔ ｓｔｒｉａｔｕｍ ｃｏｒＤｅｒａ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｅｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ． ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｔｏｔａｌｌｙ ４８ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．（ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒ０ｍ ｄａｙ ３．ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｔ ｄａｙ １４ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ｄａｙ ６０．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｄａｙｓ ３，７，１４ ａｎｄ ６０，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌ Ｉｇｒｏｕｐ：１９．５７±４＿２７．２２＿２５±４．５３．３９．１３±４．５２．７．１３± ２－７５；ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｇｒｏｕｐ：３９．８８￣４ ２６，４Ｏ．５０￣４．Ｏ３，５６．８８￣９．３３．１７．１３±４ Ｏ９．Ｐ＜０．Ｏ５．Ｐ＜０．０１）．Ａｔ ｄａｙｓ ３ ａｎｄ ７，ｃｅｌＩ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ Ｂｒｄｕ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ａｔ ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｋ．Ａｔ ｄａｙ １ ４．Ｂｒｄｕ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅａｃｈｅｄ ａ ｐｅａｋ ａｎｄ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ，ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｔ ｄａｙ ６０．ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ０ｆ Ｂｒｄｕ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ．￣Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ａｐｅｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ【ａｔ ｄａｙｓ ３。７，１ ４ ａｎｄ ６０ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｍｐｌｅ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ｇｒｏｕｐ：（３５．５７± １．８５）％，（２８．５８￣１．２６）％，（１７．８６￣１．３２）％，（２．０５￣０．６７）％；ｃｏ．ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔａｒｎｓｐｌａｎｔ ｇｒｏｕｐ：（２４．７７￣２ ４４）％．（２２．７５￣３．４Ｏ）％， （９．８８￣１．８１）％，（０．７５￣０．３２）％，Ｐ＜０．Ｏ５，Ｐ＜０．０１１． Ｃ０ＮＣＬＵＳＩＯＮ： Ｃｏ・ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｆ Ｉａｍｉｎｉｎ． ｂｒａｉｎ ＶＥＣｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃｅｒｅｂｒａＩｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ ａｃｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｉｔｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｚｈａｎｇ ＸＭ．Ｗａｎｇ ＹＬ．Ｚｈｕ ＸＦ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏ・ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ ２００７；１ １ ｆ２０）：３９６０—３９６３ （Ｃｈｉｎａ） ［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍｌｚｇｌｃｋｆｌｅｊｏｕｒｎａｌｌＬＩｐｆｉｌｅｓ／０７－２０／２０ｋ－３９６０（ｐｓ）ｐｄｆｌ 摘要 目的：将由神经干细胞、层黏连蛋白、脑微血管内皮细胞构建的共移植体植入缺血模型鼠大脑内．观察共移植体中神经干细胞 的增殖和凋亡。 方法：实验于１９９６－０１／１９９６—１２在佳木斯大学神经科学所完成。实验材料：同一基因背景Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体质量３００～３５０ ｇ，雄 性，６月龄，购自哈尔滨医科大学实验动物学部。实验方法： 取出生２４ ｈ内Ｗｉｓｔａｒ新生鼠，培养神经干细胞 ②将传代脑微血 管内皮细胞消化后，以３ｘｌ０ Ｌ 密度接种于培养瓶中，１２ ｈ贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液．涂以一层细胞外基质后，接 种经Ｏ．１２５％胰酶消化２０ ｍｉｎ后吹打成单细胞的神经干细胞悬液，密度为６ｘｌ０８ ，加入神经干细胞完全培养液。培养３～６ ｈ， 镜下观察神经干细胞完全贴壁后，吸出培养液，再涂以一薄层细胞外基质，接种以上相同密度脑微血管内皮细胞，加入神经干细 胞完全培养液。共培养１２－２４ ｈ，镜下观察脑微血管内皮细胞。利用免疫荧光方法检测共移植体。（ 制备大鼠脑缺血模型。模型 制备完成后大鼠虽然有脑缺血症状，但伴下列情形之一的不纳入：神经学症状评分低于２分；取脑时发现蛛网膜下腔出血；脑组 织石蜡切片苏木精一伊红染色无缺血病理改变；未到观察时相点便死亡的。共４８只大鼠模型制作成功。将Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为 神经干细胞组、共移植体组，每组２４只。２组分４个时间点３，７，１４，６Ｏ ｄ，每个时间点６只。模型建立后３ ｄ，神经下细胞组移植 神经干细胞，共移植体组移植共移植体，各５ Ｌ。移植前神经干细胞经Ｂｒｄｕ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ标记３ ｄ，再将其溶解于ＰＢＳ中，细胞密 度调整为２ｘｌ０”Ｌ～，移植部位为右侧纹状体区。通．过免疫组织化学和免疫荧光方法观察神经干细胞增殖和凋亡情况。 结果：４８ 均进入结果分析。①神经干细胞增殖情况：细胞数３ ｄ开始增加，１４ ｄ达高峰，６０ ｄ减少。两组３，７，１４，６０ ｄ Ｐ ０．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 维普资讯 http://www.cqvip.com 翌 ： 鐾錾 嬖 竺 竺 澡鼍鬻ｌｉ Ｒ亳 １％一３％的神经干 细胞移植后，细 胞可长期存活． 细胞数相比，差异显著（神经干细胞组：１９．５７＋４．２７，２２．２５＿＋４．５３，３９．１３－．４．５２，７．１３＋２．７５；共移植体组：３９・８８士４・２６，４０－５０＋ ４．０３．５６．８８±９．３３．１７．１３士４．０９，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。３，７ ｄ细胞增殖数较稳定，Ｂｒｄｕ阳性细胞主要集中在针迹部位，１４ ｄ Ｂｒｄｕ阳性细胞最多，散在分布，部分与周围组织整合，６０ ｄ Ｂｒｄｕ阳性细胞细胞数下降，大部分已与周围组织整合。 神经干 细胞凋亡率情况：随着时间延长，共移植体组细胞凋亡率降低，与神经干细胞组相比，差异显著【单纯神经干细胞组３，７，１４， ６０ ｄ分别为：（３５．５７＋１．８５）％，（２８．５８＋１．２６）％，（１７．８６＋１．３２）％，（２．０５＋０．６７）％；共移植体组分别为：（２４．７７＋２．４４）％， 不能简单的将这 种现象归因于免 疫排斥．因为即 使采用各种免疫 移植药物．也不 能显著延长细胞 移植物的存活。 同时移植后干细 胞很难继续保持 （２２．７５＋３．４０）％，（９．８８＋１．８１）％，（０．７５＋０．３２）％，尸＜０．０５，Ｐ＜０．０１］。 结论：层黏连蛋白和脑微血管内皮细胞与神经干细胞共移植体移植入缺血模型大鼠脑内可明显促进神经干细胞增殖，减少其凋亡。 关键词：移植体；缺血；增殖；凋亡 张晓梅，王玉琳，朱晓峰层黏连蛋白与脑微血管内皮细胞对共同植入缺血模型大鼠脑内神经干细胞增殖与凋亡的调节【Ｊ】．中国组织工程研究与 临床康复，２００７，１ １（２０）：３９６０．３９６３ 【ｗｗｗ ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｍａｌ／ｕ ｌｅｓ／０７—２０／２０ｋ－３９６０（ｐｓ）．ｐｄｆ］ 液，调整细胞密度为５ｘｌ０。Ｌ～，加入２５ ｃｍ 培 自我更新的能 力。这些现象可 能导致移植的失 败．严重制约了 ０引育 养瓶中，放入适量完全培养液，放入３７℃、体 积分数为０．０５的ＣＯ２，８０％Ｈ２Ｏ条件下培养。 近２０年来，替代疗法可以直接或间接替 神经干细胞共移植体的构建：将传代脑血 代已经坏死的神经细胞和组织，重建神经网 管内皮细胞用０．２５％胰酶消化２０ ｍｉｎ后，轻 络，部分恢复已丧失的神经功能【１＇ 。有报道神 轻吹打成单细胞，以３ｘｌ ０ Ｌ 密度接种在培养 经干细胞移植后，仅有１％～３％的细胞长期存 瓶中，１２ ｈ贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养 活，这严重制约了神经干细胞的替代疗法在临 液，涂以一层细胞外基质后接种经０．１２５％胰 床上的应用。如果这种现象简单归因于免疫排 酶消化２０ ｒａｉｎ后吹打成单细胞的神经干细胞 斥是不全面的。因为即使应用各种抗免疫排斥 悬液，密度为６ｘｌ０。Ｌ～，加入神经干细胞完全 药物，也不能显著延长移植物和存活【引。神经 培养液。培养３～６ ｈ，经镜下观察神经干细胞完 干细胞的增殖、凋亡主要依赖于周围特殊环 全贴壁后，吸出培养液，再涂以一薄层细胞外 境，即Ｎｉｃｈｅ（小生境）【 ，移植后神经干细胞往 基质，接种以上相同密度的脑血管内皮细胞， 往都因血流阻断，内稳态失衡，炎症反应最终 加人神经干细胞完全培养液。７０ ｍＬ培养瓶接 导致移植失败。文献报道层黏连蛋白促进细胞 种两种细胞分别是４ ｍＬ。共培养１２～２４ ｈ，镜 黏附和迁移的作用较强，但促进细胞增殖的作 下观察最后接种脑微血管内皮细胞贴壁情况， 用不明显【 ，刚。 并由消化后的圆形变为椭圆或不规形。用细胞 刮刀将细胞从瓶壁上依次刮起，适力吹打，用 １材料和方法 １５０目细胞筛网过滤，取滤液再用５００目细胞 筛网过滤，取筛网上细胞团。利用免疫荧光的 设计：以细胞及实验动物为对象观察实 方法，以Ⅷ因子标记物标记脑血管内皮细胞， 验。 用ｎｅｓｔｉｎ标记神经干细胞，检测共移植体。 单位：佳木斯大学神经科学研究所。 动物分组及模型制作：模型制备主要采用 材料：实验于１９９６—０１／１９９６—１２在佳木 周锡英等【 】方法。模型制备完成后大鼠虽然有 斯大学神经科学所完成。同一基因背景Ｗｉｓｔａｒ 脑缺血症状，但伴下列情形之一的不纳入：神 大鼠，体质量３００～３５０ ｇ，雄性，６月龄，购自 经学症状评分低于２分；取脑时发现蛛网膜下 哈尔滨医科大学实验动物学部。 腔出血；脑组织石蜡切片苏木精一伊红染色无 设计、实施、评估者：实验的设计及干预实 缺血病理改变；未到观察时相点便死亡的。凡 施为全部作者，经过正规培训。 因上述因素导致各实验组动物数不足预定数 方法：神经干细胞分离、培养、纯化及传 量者通过随机抽样原￣ＪＪ＋ｌ－齐。共４８只大鼠缺 代：取出生２４ ｈ内Ｗｉｓｔａｒ新生鼠，体积分数 血模型建立成功，将Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为２ 为０－７５乙醇消毒，在超净工作台中，无菌操作 组：神经干细胞组（作为对照）、共移植体组，每 取材，在大小脑交界处将大脑皮质向上卷起， 组２４只。两组再分别选择４个时间点３，７， 取出海马组织，在Ｈａｎｋ’ｓ缓冲液漂洗二三 １４，６０ ｄ，每个时间点６只大鼠。 次，并移置预先加入适量完全培养液 ５一溴脱氧尿苷嘧啶（Ｂｒｄｕ）标记、共移植体 （ＤＭＥＭ／Ｆ１２，２％Ｂ２７，２０ Ｉ￣ｇ／Ｌ ＥＧＦ）的／Ｊ、瓶 直入和组织固定：共移植体（图１）由本实验组 中，剪成１ ｍｍ。左右的小块，吹打成细胞均 提供并鉴定。模型建立后３ ｄ，神经干细胞组移 浆，用４００目滤网过滤细胞均浆制成单细胞悬 植神经干细胞，共移植体组移植共移植体，各 沈阳１２００邮政信箱１ １０００４ ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｌｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ ｃｏｍ 神经千细胞移植 治疗的临床应 用。最近的一些 研究发现，干细 胞的自我更新、 增殖分化主要依 赖于周围特殊的 微环境．即Ｎｉｃｈｅ （小生境），构建人 工神经干细胞 Ｎｉｃｈｅ可能有助 于提高移植后细 胞的长期存活。 ３９６１ 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 张 等．霜藿 是善 雩筠笔竺 ！兰 竺 竺 植体对移人体内的神经干细胞有保护作用。 移植后１４ ｄ共移植体组中神经干细胞增殖比单 纯干细胞组明显增高，凋亡率显著下降，移植后６０ ｄ 时两组其增殖与凋亡率仍有差异。这可能由于共移植 体中的脑微血管内皮细胞和层黏连蛋白参与了缺血半 与神经干细胞组比较， Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ 暗区的血管的新生及血脑屏障的建立，这不仅为神经 干细胞的增殖提供了营养来源，而且抑制其凋亡。而单 纯神经干细胞的移植由于缺乏脑微血管内皮细胞的支 持，整合能力下降，血管重建和血脑屏障建立较慢，神 ３讨论 神经干细胞在神经营养因子的调控下可分化成 某些类型的神经细胞，并对因缺血损伤造成的神经功 能丧失具有代偿和修复作用。 神经干细胞在体内和体外均能被诱导分化成神 经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此神经干细 胞的移植有望成为治疗多种中枢神经系统棘手疾病 的理想方法。现如今神经干细胞的基础资料如其存 活、增殖、分化及调空理论成为生命科学研究的首要 问题。尽管治疗缺血性脑损伤可采用激活内源性神经 干细胞和将神经干细胞植入脑的损伤部位两种方法， 但目前移植是最深入的研究治疗手段【 。 在实验中发现，在移植早期（３，７ ｄ）时，移植人大 鼠缺血模型脑内的单纯神经干细胞组凋亡率明显高 于共移植体组，并且共移植体组中的神经干细胞有一 定的增殖，而单纯神经干细胞组增殖不明显，可能是 与脑缺血后早期，血流阻断，内稳态失衡，炎症介质释 放，缺血半暗区神经干细胞生存的内环境遭到破坏有 关。单纯将神经干细胞植入缺血半暗区，使细胞营养 供应不足和细胞间微信号调节中断，使植入的神经干 细胞发生依赖于ｂａｘ基因启动的凋亡和失巢凋亡， 神经干细胞的凋亡增加，而细胞增殖不明显。而共移 植体植入缺血半暗区后，脑微血管内皮细胞和层黏连 蛋白与神经干细胞相互作用，可进行细胞间信息交 流，极大地模拟体内环境。其中脑微血管内皮细胞可 分泌一些可溶性细胞因子，如胰岛素样生长因子、脑 微血管内皮细胞生长因子等能促进神经干细胞的增 殖［６，７，１３－１ ５１，抑制其凋亡【 。在体内层黏连蛋白除对神 经干细胞有保护作用减少其凋亡外【伺，层黏连蛋白还 模拟类神经生长因子的营养神经的作用，促进神经干 细胞增殖【伺。通过模拟小生境也可以解决失巢凋亡的 发生【’ ，侧。 同时实验也发现，移植早期也是细胞凋亡的高峰， 无论是单纯神经干细胞组，还是共移植体组都如此，这 可能还与炎症反应、免疫等因素有关。但共移植体组神 经干细胞凋亡仍少于单纯神经干细胞移植，说明共移 沈阳１２ｏ０邮政信箱１１０００４ ｋｌＺａａＳ￣＠＝ｒｅ．∞ｍ ｗｗ ｌ ∞ｍ 经干细胞的增殖及凋亡率变化不明显。 总之，神经干细胞增殖有赖于其生存的环境，共移 植体可以减少移植后的失巢凋亡，也可通过加快整合 来减少细胞凋亡，促进干细胞的增殖。共移植体既有利 于缺血早期移植神经干细胞的存活、增殖，抑制其凋 亡，又有利于移植人脑缺血大鼠模型的神经干细胞长 期存活和增殖。共移植体抑制神经干细胞凋亡及促增 殖的作用机制还有待于进一步研究。 ４参考文献 １ Ｈａａｓ Ｓ．Ｗｅｉｄｎｅｒ Ｎ．Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｊ．Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａＰＹ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２００５：１８（１）：５９－６４ ２ Ｓｚｅｎｔｉｒｍａｉ Ｏ． Ｃａｒｔｅｒ ＢＳ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃｅｒｅｂｒａＩ ＿ｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ２００４￣５５（２）：２８３－２８６ ３ Ｔｏｄａ Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｊ．Ｌｗａｋａｍｉ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２００１：３１６（１）：９．１２ ４ Ｆｕｃｈｓ Ｅ，Ｔｕｍｂａｒ Ｔ，Ｇｕａｓｃｈ Ｇ．Ｓｏｃｉａｌｉｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ：ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｉｃｈｅ．Ｃｅｌｌ ２００４；１ １６（６）：７６９．７７８ ５ Ｍｏｌｔｅｒ Ｅ． ＣｅｉＩｉｎｔａｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｉｔｖ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ １９９５；２７（１）：２４・２７ ６ Ｏｌｉｅｒｏ ＤＫ，Ｆｕｒｃｈｔ．Ｔｙｐｅ １Ｖ ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｌａｍｉｎｉｎ，ａｎｄ ｉｆｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｌｅｎｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９９３：３４：２８２５－２８３４ ７ 周锡英，马宁，张北奇，等．建立实验性大鼠单侧局部脑梗塞模型的新方法【Ｊ】． 中国病理生理杂志，１９９７．１ ３《５）：５３２・５３３ ８ Ｈｅｓｓ ＤＣ，Ｈ．１ｌＷＤ，Ｃａｎｏｌｌ Ｊ Ｅ＿ｅｔ ａ１．Ｄｏ ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｅｕｒｏｎｓ？Ｊ Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４；６１ｆ４）：４８３４８５ ９ 尹晓娟，封志纯，杜江．分离培养不同胚龄人神经干细胞的方法比较【Ｊ】．中国 临床康复，２Ｏ０４，８（９）：１７２昏１７２７ １０ 尹晓娟，杜江，封志纯．人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探【Ｊ】．第 三军医大学学报，２００４，２６（２２）：２０６１・２０６３ １１ 邝玉子，王世芳，肖卫民，等．脑干诱发电位对新生儿缺氧缺血性脑病脑功能 状态的评估价值【Ｊ】ｌ中国临床康复，２００４．８（１８）：３５７２—３５７３ １２ Ｇａｌｚｅ Ｌ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｍ．Ｇｉｕｌｉａｒｉ Ａ．ｅｔ ａ１．Ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ａｎｄ ｎｅｒｖｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｏａｉｒｓ ｆｒ０ｍ｜ｎｖｉｃｒｏ ｔｏ ｉｎｖｉｖｏ．Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２０Ｏ４：１４６（２）：７５－９１ １３ 王欣玲，张劲松，于韬．层黏连蛋白和纤维连接蛋白对人晶状体上皮细胞生 长特性的影响【Ｊ】ｌ中华眼科杂志，２００５．４１（４）：３４０－３４５ １４ ｃａｓｔｉｌｌａ ＭＡ．Ｃａｒａｍｅｌｏ Ｃ．Ｇａｚａｐｏ ＲＭ．ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｖＥＧＦ） ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌａｉＩ ｃｅｌＩ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０００；６７（９）：１００３－１０１３ １５ Ｊｏｈｎｓｔｅｍ ＢＭ． Ｍａｌａｉｒｄ ＥＣ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＣＥ，ｅｔ ａ１． １ｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１ ｉｓ ａ ｐｏｒｅｎｔ ｎｅｕｒｏｎａＩ ｒｅｓｃｕｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｆｅｔａｌｌａｍｂｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ ｌｎｖｅｓｔ １９９６：９７（２）：３１０－３ｏ８ １６ ｗｅｅｎｅｙ ＴＭ，Ｋｉｂｂｅｙ ＭＣ．Ｚａｉｎ Ｍ．ｅｔ ａｉ．Ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＳＩＫＶＡＶ ｌａｍｉｎｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １９９１：１０：２４５－２５４ １７ ａｖｉｓ ＧＥ．Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ Ｍ．Ｅｎｇｖａｌｌ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ ｎｅｕｒｉｔｅ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔ０ｒ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｌａｍｉｎｉｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１９８５；５（１０）：２６６２—２６７１ １８ Ｚｈａｎ Ｍ，Ｚｈａｏ Ｈ，Ｈａｎ ｚＣ．Ｓ．岣ｎａｉｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｎｏｉｋｉｓ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０Ｏ４：１９（３）：９７３－９８３ ３９６３