丹参多酚酸盐及其制备方法和用途[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103980236 A(43)申请公布日 2014.08.13

(21)申请号 201410163341.0(22)申请日 2009.11.17(62)分案原申请数据

200910223497.2 2009.11.17

(71)申请人中国科学院上海药物研究所

地址201203 上海市浦东张江祖冲之路555

号

申请人上海绿谷制药有限公司(72)发明人宣利江 王逸平 史晓浩 李平(74)专利代理机构北京市金杜律师事务所

11256

代理人陈文平(51)Int.Cl.

A61P 9/14(2006.01)A61P 3/10(2006.01)A61P 29/00(2006.01)

C07D 307/86(2006.01)A61K 31/343(2006.01)A61P 7/02(2006.01)A61P 9/00(2006.01)A61P 9/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书14页 附图3页权利要求书1页 说明书14页 附图3页

(54)发明名称

丹参多酚酸盐及其制备方法和用途(57)摘要

本发明公开了一种制备丹参多酚酸盐的方法，包括用50％以上的乙醇提取丹参药材，大孔吸附树脂吸附，10％以下和15-25％的乙醇用水、梯度洗脱，以及醇沉等步骤。用该方法获得的丹参多酚酸盐，其中丹参乙酸镁的含量可达80％以上，原儿茶醛的含量显著降低，并且丹参多酚酸盐的产率可以到3％以上。本发明还公开了所述丹参多酚酸盐的制药用途，即用于制备治疗心血管疾病和糖尿病并发肢端循环障碍疾病的药物。CN 103980236 ACN 103980236 A

权 利 要 求 书

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1.一种从丹参中提取的丹参多酚酸盐，其中含有丹参乙酸镁和原儿茶醛，丹参乙酸镁的含量为80％(W/W)以上，原儿茶醛的含量低于0.03％(W/W)。

2.如权利要求1所述的丹参多酚酸盐，其中丹参乙酸镁的含量为80-90％(W/W)。3.如权利要求1或2所述的丹参多酚酸盐，其中原儿茶醛的含量低于0.02％(W/W)。4.如权利要求3所述的丹参多酚酸盐，其中原儿茶醛的含量低于0.01％(W/W)。5.丹参多酚酸盐在制备用于治疗肢端循环障碍、治疗微循环障碍、改善血液循环、防止血栓形成或者抗炎的药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述肢端循环障碍是糖尿病并发肢端循环障碍疾病。

7.如权利要求5或6所述的用途，其中所述丹参多酚酸盐含有80％(W/W)以上的丹参乙酸镁。

8.如权利要求5或6所述的用途，其中所述药物是冻干粉针剂。

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说 明 书

丹参多酚酸盐及其制备方法和用途

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本申请是申请号为200910223497.2、申请日为2009年11月17日、发明名称为“丹

参多酚酸盐及其制备方法和用途”的发明专利申请的分案申请。

[0001]

技术领域

[0002]

本发明涉及中药提取精制领域，具体地说，涉及一种制备丹参多酚酸盐的方法、用该方法获得的丹参多酚酸盐及其用途。

背景技术

[0003] 近年来，心血管疾病的发病率逐年增加，据统计目前中国有高血压患者1亿多人，冠心病患者一千多万，可见心血管疾病逐渐成为危害人民健康的“第一杀手”。寻找和研制有效的心血管疾病治疗药一直是药物研究领域的重点。传统中药在本领域已显示了很强的优越性，其中较为著名的是丹参及其制剂。

[0004] 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是传统的活血化瘀中药之一，有长期的临床应用基础，其中，丹参注射液在临床上广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性中风等疾病的治疗。但传统丹参注射剂因有效成分不明确、质量控制指标不严格导致临床疗效不稳定，不良反应时常出现，已不符合中药现代化和走向国际化的要求。这些问题的出现，关键是丹参的有效成分未能完全阐明。

[0005] 丹参的化学成分主要由脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的多酚酸盐类化合物两部分组成。大量的药理和临床研究结果表明丹参的水溶性成分是丹参制剂、尤其是注射剂的药理活性成分。

[0006] 本发明人开展了丹参的水溶性成分的系统研究，发现丹参的水溶性有效成分均以盐的形式存在于生药材中，这些成分主要为丹参乙酸镁及其同系物：紫草酸镁、迷迭香酸钠、丹参乙酸二钾、异丹参乙酸二钾、丹参素钾和紫草酸二钾等。通过活性筛选和药理学研究发现，丹参乙酸镁和它的 同系物均为活性成分，其中以丹参乙酸镁药理作用最强，它是丹参的主要活性成分，由此，本发明人提出将丹参乙酸镁的含量作为为丹参提取物的质量控制的关键指标。

[0007] 丹参多酚酸盐是丹参的一种提取物，目前临床上用于静脉滴注，其主要成分是丹参乙酸镁，还含有紫草酸镁、迷迭香酸钠等。CN1247855A公开了一种丹参多酚酸盐的制备方法，其包括热水提取、大孔吸附树脂吸附、30-80％的乙醇洗脱和无水乙醇醇沉等提取和纯化步骤，然而该方法所得的丹参多酚酸盐中丹参乙酸镁的含量仅能达到60％，而临床应用产品的要求为80-90％，因此其不能满足临床应用产品的含量要求。CN1911272A也公开了一种丹参多酚酸盐的制备方法，其包括热水提取、大孔吸附树脂吸附、20％和50％的乙醇梯度洗脱和二次乙醇醇沉等提取和纯化步骤，虽然所得丹参多酚酸盐中丹参乙酸镁的含量可以达到80-90％，但是其产率最高仅为2％，不利于药材资源的保护和利用；此外，用该方法制得的丹参多酚酸盐中原儿茶醛的含量约为0.058％，而原儿茶醛含有的醛基为化学活泼基团，通常不在药物结构中出现，其易和体内蛋白产生非特异性结合，因此有毒副作用的风

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说 明 书

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险，含量过高将不利于产品的安全性。[0008] 由此可见，现有技术中所提供的丹参多酚酸盐及其制备方法还不能完全满足临床应用以及资源保护的要求。发明内容

本发明的目的在于提供一种制备丹参多酚酸盐的方法，与现有技术方法相比，用

该方法可以以更高的收率获得纯度符合临床要求的丹参多酚酸盐，同时可以降低不希望的杂质的含量。具体地讲，按本发明方法制备的产品中丹参乙酸镁的含量可达80％以上(优选80-90％)，原儿茶醛的含量显著降低(至少低于0.03％)，并且丹参多酚酸盐的产率可以到3％以上。

[0010] 本发明所提供的制备丹参多酚酸盐的方法，包括：[0011] (1)用50％(V/V)以上的乙醇提取丹参药材，获得提取液；[0012] (2)浓缩步骤(1)的提取液，获得浓缩液；[0013] (3)用水稀释步骤(2)的浓缩液，获得稀释液；[0014] (4)将步骤(3)的稀释液吸附于大孔吸附树脂；[0015] (5)用水洗脱；

[0016] (6)用10％(V/V)以下的乙醇洗脱；[0017] (7)用15-25％(V/V)的乙醇洗脱，并收集洗脱液；[0018] (8)浓缩步骤(7)的洗脱液，获得浓缩液；

[0019] (9)向步骤(8)的浓缩液中加入乙醇进行醇沉，过滤，获得滤液；

[0009] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024]

(10)浓缩步骤(9)的滤液；和

(11)任选地干燥步骤(10)的浓缩液。优选地，其中步骤(1)中所述的乙醇浓度为50-95％(V/V)。优选地，其中步骤(1)中所述的乙醇浓度为70％(V/V)。优选地，其中步骤(1)中所述的乙醇浓度为70％(V/V)，提取次数为3次，每次2优选地，其中步骤(1)在回流条件下进行。优选地，其中步骤(2)中浓缩液在50-60℃时的相对密度为1.00-1.20。优选地，其中步骤(2)中浓缩液在50-60℃时的相对密度为1.05-1.15。优选地，其中步骤(2)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度80℃以下进行。优选地，其中步骤(3)的稀释液在室温时的相对密度为0.92-1.12。优选地，其中步骤(3)的稀释液在室温时的相对密度为0.97-1.07。优选地，其中步骤(1)的提取液和/或步骤(3)的稀释液经过滤后再进入下一步优选地，其中步骤(4)的大孔吸附树脂选自聚二乙烯苯型大孔吸附树脂。优选地，其中步骤(5)洗脱糖、蛋白质和无机盐。优选地，其中步骤(6)洗脱非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物。优选地，其中步骤(6)中的乙醇浓度为3-10％(V/V)。优选地，其中步骤(7)洗脱丹参乙酸盐。

4

小时。

[0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031]

骤。

[0032] [0033] [0034] [0035] [0036]

CN 103980236 A[0037] [0038] [0039] [0040] [0041]

说 明 书

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优选地，其中步骤(7)中的乙醇浓度为20％(V/V)。优选地，其中步骤(8)中的浓缩液在40-50℃时的相对密度为1.10-1.30。优选地，其中步骤(8)中的浓缩液在40-50℃时的相对密度为1.15-1.25。优选地，其中步骤(8)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度80℃以下进行。优选地，其中步骤(9)中乙醇加入的量使浓缩液中的乙醇浓度达到90％(V/V)以

上。

优选地，其中步骤(9)中乙醇加入的量使浓缩液中的乙醇浓度达到90％(V/V)。

[0043] 优选地，其中步骤(9)中所加入的乙醇是95％乙醇(V/V)或无水乙醇。[0044] 优选地，其中步骤(9)中取上清液进行过滤。[0045] 优选地，其中步骤(10)中获得浓缩液，其在30-50℃时的相对密度为1.00-1.20。[0046] 优选地，其中步骤(10)中获得浓缩液，其在30-50℃时的相对密度为1.05-1.15。[0047] 优选地，其中步骤(10)中直接获得干燥产品。[0048] 优选地，其中步骤(10)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度60℃以下进行。[0049] 优选地，其中步骤(11)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度60℃以下进行。[0050] 另一方面，本发明涉及由上述方法制得的丹参多酚酸盐。

[0051] 本发明的另一个目的在于提供一种从丹参提取的丹参多酚酸盐，其中原儿茶醛的含量低于0.03％(W/W)，优选低于0.02％(W/W)，更优选低于0.01％(W/W)。[0052] 优选地，上述从丹参提取的丹参多酚酸盐中丹参乙酸镁的含量为80％以上，更优选其中丹参乙酸镁的含量为80-90％。

[0053] 按照本发明的方法可以获得上述从丹参提取的丹参多酚酸盐。[0054] 丹参多酚酸盐可用于治疗心血管疾病。本发明人在对上述丹参多酚酸盐进行药理学研究时发现其在大鼠血栓闭塞性肢端循环障碍模型、大鼠微循环障碍模型、大鼠动静脉旁路血栓形成模型以及大鼠实验性棉球肉芽肿模型中均取得显著的缓解或治疗效果，这显示丹参多酚酸盐具有治疗肢端循环障碍、改善血液循环、防止血栓形成和抗炎症作用，可防治糖尿病并发肢端循环障碍性疾病。因此本发明的再一个目的是提供上述丹参多酚酸盐的制药用途，即用于制备治疗选自心血管疾病和糖尿病并发肢端循环障碍疾病的药物。[0055] 优选地，所述心血管疾病选自冠心病、心绞痛、心肌梗塞和缺血性中风。[0056] 本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，其含有上述从丹参提取的丹参多酚酸盐和药学上可接受的载体。

[0057] 所述药物组合物的形式取决于给药的方法，并且对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，2001描述了多种形式的药物组合物。

[0058] 所述药学上可接受的载体指一种或多种相容的固体或液体传输系统，当其给予对象时具有无害的生理反应。一些例子包括，但不限于淀粉、糖、纤维素及其衍生物、粉末化的黄芪胶、麦芽、明胶、胶原、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、多元醇、琼脂、海藻酸、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲液和其它在药物制剂中使用的合适的非毒性物质。其它赋形剂例如湿润剂和润滑剂、制片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂也包括在内。[0059] 所述药物组合物可采用适合于几乎任何给药方式的形式，包括例如局部、眼部、口服、口腔、全身、鼻腔、注射、透皮、直肠、阴道等给药方式，或者采用适合于通过吸入或吹入

[0042]

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给药的形式。

[0060] 适合于口服给药的药物组合物可以选自胶囊、微囊或者片剂。这些药物组合物可以含有色素、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和制药上相容的载体中的一种或多种，例如含有乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸中的一种或多种。适合于肠胃外给药的药物组合物，例如，例如通过关节内(在关节内)、静脉内、肌内、皮内、腹腔和皮下途径给药的组合物，包括水性和非水性的、等渗的无菌注射溶液，以及水性和非水性的无菌悬浮液。所述无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使制剂与预期的受药者体内血液等渗的溶质。所述无菌悬浮液可以含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

[0062] 所述药物组合物可采用单位剂量的形式以方便准确计量。术语“单位剂型”是指适用于人或者其他哺乳动物单位剂量的离散单位，每单位含经计算产生所需治疗效果的预定量丹参多酚酸盐以及合适的药学上可接受的载体。典型的单位剂型包括预装填，预定量的安瓿剂或液体组合物的注射剂或固体组分的丸剂、胶囊剂等。实际的给药剂量通常由医师决定，取决 于相关环境，包括所治疗的病症、选择的给药途径、实际给用的化合物、年龄、体重、病人个体的反应，以及症状的严重程度等。[0063] 优选地，所述药物组合物是适合于注射给药的组合物。[0064] 优选地，所述药物组合物含有上述从丹参提取的丹参多酚酸盐和水。[0065] 优选地，所述药物组合物是冻干粉针剂。[0066] 优选地，所述冻干粉针剂通过将上述从丹参提取的丹参多酚酸盐溶解于水中后，再通过冷冻干燥制得。[0067] 优选地，所述冻干粉针剂的规格为50mg/瓶、100mg/瓶、200mg/瓶、300mg/瓶或400mg/瓶。

[0068] 任选地，所述药物组合物在需要时可以含有其它活性成分。[0069] 本发明所用的原料均可以通过商购获得，其中丹参药材为符合中国药典要求的野生或人工栽培的丹参(Salvia miltiorrhiza)的根茎；大孔吸附树脂可以是日本三菱化学的HP20、以及国产的D101、1300-1、AB-8等聚二乙烯苯型大孔吸附树脂(不含离子交换基团)，例如扬州制药厂生产的1300-I大孔吸附树脂；本发明中所涉及的乙醇浓度或含量，如无特别说明，均为体积百分含量。

[0061]

本发明所定义的“丹参乙酸镁的含量”，是指使用HPLC分析的方法，以丹参乙酸(即丹酚酸B)为对照品，通过外标法检测产品中丹参乙酸的含量(W/W)，然后乘以丹参乙酸镁和丹参乙酸的分子量比值换算成丹参乙酸镁的含量(W/W)。所述HPLC分析的方法可以是以下方法：

[0071] 色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-5mmol/L磷酸二氢钾溶液(30：70)为流动相；检测波长为290nm。理论板数按丹酚酸B计算应不低于1500，丹酚酸B峰与相邻峰的分离度应大于2.0。[0072] 对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含30μg的溶液，即得。

[0073] 供试品溶液的制备：取本发明的产品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，用流动相溶

[0070]

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解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。[0074] 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱 仪，测定，按照以下公式计算，即得：

[0075]

A样：供试品峰面积；[0077] W标：标准品称重(mg)；[0078] A标：标准品峰面积；[0079] C标％：标准品含量；[0080] W样：供试品称重(mg)；[0081] 1.03：换算系数，M丹参乙酸镁/M丹酚酸B＝740/718＝1.03。[0082] 本发明的产品含丹参乙酸镁应为80％以上，优选80-90％。[0083] 本发明所定义的“原儿茶醛的含量”，是指使用HPLC分析的方法，以原儿茶醛为对照品，通过外标法检测产品中原儿茶醛的含量(W/W)，所述HPLC分析的方法可以是以下方法：

[0076]

色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-4％乙

酸水(20：80)为流动相；检测波长为280nm，流速为1ml/min。[0085] 对照品溶液的制备：取原儿茶醛对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.5μg的溶液，即得。

[0086] 供试品溶液的制备：取丹参多酚酸盐适量，精密称定，加流动相分别配制成每1ml含2.5mg的溶液，即得。[0087] 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0088] 本发明还涉及以下项目：

[0089] 1.一种制备丹参多酚酸盐的方法，包括：[0090] (1)用50％(V/V)以上的乙醇提取丹参药材，获得提取液；[0091] (2)浓缩步骤(1)的提取液，获得浓缩液；[0092] (3)用水稀释步骤(2)的浓缩液，获得稀释液；[0093] (4)将步骤(3)的稀释液吸附于大孔吸附树脂；[0094] (5)用水洗脱；

[0095] (6)用10％(V/V)以下的乙醇洗脱；[0096] (7)用15-25％(V/V)的乙醇洗脱，并收集洗脱液；[0097] (8)浓缩步骤(7)的洗脱液，获得浓缩液；

[0098] (9)向步骤(8)的浓缩液中加入乙醇进行醇沉，过滤，获得滤液；[0099] (10)浓缩步骤(9)的滤液；和

[0100] (11)任选地干燥步骤(10)的产品。[0101] 2.如项目1所述的方法，其中步骤(1)中所述的乙醇浓度为50-95％(V/V)，优选

[0084]

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70％(V/V)。

[0102] 3.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(1)中所述的乙醇浓度为70％(V/V)，提取次数为3次，每次2小时。

[0103] 4.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(1)在回流条件下进行。[0104] 5.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(2)中浓缩液在50-60℃时的相对密度为1.00-1.20，优选为1.05-1.15。

[0105] 6.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(2)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度80℃以下进行。

[0106] 7.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(3)的稀释液在室温时的相对密度为0.92-1.12，优选为0.97-1.07。

[0107] 8.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(1)的提取液和/或步骤(3)的稀释液经过滤后再进入下一步骤。

[0108] 9.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(4)的大孔吸附树脂选自聚二乙烯苯型大孔吸附树脂。

[0109] 10.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(5)洗脱糖、蛋白质和无机盐。[0110] 11.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(6)洗脱非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物。

[0111] 12.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(6)中的乙醇浓度为3-10％(V/V)。

[0112] 13.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(7)洗脱丹参乙酸盐。[0113] 14.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(7)中的乙醇浓度为20％(V/V)。[0114] 15.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(8)中的浓缩液在 40-50℃时的相对密度为1.10-1.30，优选为1.15-1.25。[0115] 16.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(8)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度80℃以下进行。

[0116] 17.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(9)中乙醇加入的量使浓缩液中的乙醇浓度达到90％(V/V)以上，优选90％(V/V)。[0117] 18.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(9)中取上清液进行过滤。[0118] 19.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(10)中获得浓缩液，其在30-50℃时的相对密度为1.00-1.20，优选为1.05-1.15。[0119] 20.如前述项目任何一项所述的方法，其中步骤(10)和/或(11)在真空度-0.07～-0.1MPa和温度60℃以下进行。

[0120] 21.如项目1-18和20中任何一项所述的方法，其中步骤(10)中直接获得干燥产品。

[0121] 22.一种从丹参中提取的丹参多酚酸盐，其中原儿茶醛的含量低于0.03％(W/W)，优选低于0.02％(W/W)，更优选低于0.01％(W/W)。[0122] 23.如项目23所述的丹参多酚酸盐，其中丹参乙酸镁的含量为80％(W/W)以上，优选80-90％(W/W)。

[0123] 24.如项目22或23所述的丹参多酚酸盐，在制备治疗以下疾病的药物中的用途，

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说 明 书

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所述疾病是心血管疾病或糖尿病并发肢端循环障碍疾病。[0124] 25.如项目24所述的用途，其中所述心血管疾病选自冠心病、心绞痛、心肌梗塞和缺血性中风。

[0125] 26.一种药物组合物，其含有项目22或23的从丹参中提取的丹参多酚酸盐和药学上可接受的载体。

[0126] 27.如项目26所述的药物组合物，其中所述药物组合物是适合于注射给药的组合物，优选所述药物组合物含有项目22或23的从丹参提取的丹参多酚酸盐和水。[0127] 28.如项目26或27所述的药物组合物，其中所述药物组合物是冻干粉针剂。[0128] 29.如项目28所述的药物组合物，其中所述冻干粉针剂是通过将上述从丹参提取的丹参多酚酸盐溶解于水中后，再通过冷冻干燥制得。[0129] 30.如项目28或29所述的药物组合物，其中所述冻干粉针剂的规格为50mg/瓶、100mg/瓶、200mg/瓶、300mg/瓶或400mg/瓶。附图说明

[0130] [0131]

图1是原儿茶醛对照品的色谱图；

图2是实施例1的丹参多酚酸盐的微量物质色谱图；

[0132] 图3是CN1911272A中公开的丹参多酚酸盐的微量物质色谱图；

[0133] 图4a和4b是月桂酸造成大鼠肢端循环障碍模型患侧肢体组织病理图(第14天)；

[0134] 图5a和5b是丹参多酚酸盐组大鼠肢端循环障碍患侧肢体组织病理图(第14天)。具体实施方式

[0135] 实施例1丹参多酚酸盐的制备

[0136] 用丹参饮片(生药批号031222)150Kg，并以50Kg为一提取单元，每单元提取步骤如下：

[0137] ①取丹参50Kg，加入300L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液180L；残渣再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液235L；残渣再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L。滤液合并得640L。回收乙醇，得浸膏82Kg，相对密度1.091(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液305L。

[0138] 滤液缓缓投入150Kg的1300-1(扬州制药厂)大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以300L6％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L20％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得洗脱液体积120L。

[0139] 在真空度-0.07—-0.1MPa，温度≤80℃条件下对洗脱液减压浓缩，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏5.7Kg。[0140] ②取丹参50Kg，加入300L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液190L；残渣再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L；残渣再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液220L。滤液合并 得635L。回收乙醇，得浸膏95Kg，相对密度1.090(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液305L。

9

CN 103980236 A[0141]

说 明 书

8/14页

滤液缓缓投入150Kg的1300-1大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、

蛋白质及无机盐，再以300L6％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L20％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得洗脱液体积110L。[0142] 在真空度-0.07—-0.1MPa，温度≤80℃条件下对洗脱液减压浓缩，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏5.5Kg。

③取丹参50Kg，加入300L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液180L；残渣

再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液215L；残渣再加入250L70％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液235L。滤液合并得630L。回收乙醇，得浸膏87Kg，相对密度1.086(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液300L。[0144] 滤液缓缓投入150Kg的1300-I大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以300L6％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L20％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得洗脱液体积110L。[0145] 在真空度-0.07—-0.1MPa，温度≤80℃条件下对洗脱液减压浓缩，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏5.7Kg。

[0146] 合并以上①②③单元所得浸膏16.7Kg，加入301L的95％乙醇，静置两小时以进行醇沉，过滤得清液290L。滤液在真空度-0.07—-0.1MPA，温度≤60℃条件下回收乙醇，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏9.2Kg，于真空度0.08MPa，温度≤60℃条件下干燥，得干膏4.8Kg。粉碎后收粉量4.7Kg。[0147] 得率为3.1％，丹参乙酸镁的含量按照前面所描述的HPLC方法检测为82.8％。[0148] 实施例2丹参多酚酸盐的制备

[0149] 用丹参饮片(生药批号040108)150Kg，并以50Kg为一提取单元，每单元提取步骤如下：

[0150] ①取丹参50Kg，加入300L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液 165L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液250L。滤液合并得640L。回收乙醇，得浸膏98kg，相对密度1.089(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液300L。

[0151] 滤液缓缓投入150Kg的D101(天津海光化工有限公司)大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以300L5％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L18％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得合格洗脱液体积120L。

[0143]

在真空度-0.07—-0.1MPA，温度≤80℃条件下对合格洗脱液减压浓缩，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏6Kg。[0153] ②取丹参50Kg，加入300L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液195L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L。滤液合并得645L。回收乙醇，得浸膏90kg，相对密度1.089(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液310L。[0154] 滤液缓缓投入150Kg的D101大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以300L5％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L18％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得合格洗脱液体积

[0152]

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CN 103980236 A

说 明 书

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120L。

在真空度-0.07—-0.1MPA，温度≤80℃条件下对合格洗脱液减压浓缩，得到相对

密度为1.15(50℃)的浸膏5.5Kg。[0156] ③取丹参50Kg，加入300L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液180L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液235L；残渣再加入250L80％乙醇回流提取2小时，滤过，收集滤液225L。滤液合并得640L。回收乙醇，得浸膏86kg，相对密度1.086(60℃)，加水稀释至相对密度1.02，过滤，得滤液310L。[0157] 滤液缓缓投入150Kg的D101大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，用300L水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以300L5％乙醇去除非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以150L18％乙醇洗脱，每10L流出液收集一桶，经HPLC检测核实洗脱液，得合格洗脱液体积130L。

[0158] 在真空度-0.07—-0.1MPA，温度≤80℃条件下对合格洗脱液减压浓缩，得到相对密度为1.15(50℃)的浸膏6Kg。

[0159] 合并以上①②③单元所得浸膏17.5kg，加入315L的95％乙醇，静置两小时以进行醇沉，过滤后得清液310L。滤液在真空度-0.07—-0.1MPA，温度≤60℃条件下回收乙醇，得到相对密度为1.20(50℃)的浸膏10.2Kg，于真空度0.08MPa，温度≤60℃条件下干燥，得干膏5.2Kg。粉碎后收粉量5.1Kg。

[0155]

得率为3.4％，丹参乙酸镁的含量按照前面所描述的HPLC方法检测为81.8％。

[0161] 实施例3丹参多酚酸盐中原儿茶醛的含量测定

[0162] 取实施例1的丹参多酚酸盐和按照CN1911272A(实施例1)所公开方法制备的丹参多酚酸盐适量，精密称定，加流动相分别配制成每1ml含2.5mg的溶液，按照前面所描述的HPLC方法检测其中原儿茶醛的含量。[0163] HPLC图谱见图1-3，结果表明按照CN1911272A所公开的方法制备的丹参多酚酸盐中原儿茶醛的含量为0.058％，而本发明实施例1的丹参多酚酸盐中，其含量仅为0.0097％。

[0164] 按照同样的方法测定了实施例2的丹参多酚酸盐，结果发现其原儿茶醛的含量为0.0121％。

[0165] 可见本发明的丹参多酚酸盐中原儿茶醛的含量显著降低。[0166] 实施例4丹参多酚酸盐对大鼠血栓闭塞性肢端循环障碍的作用[0167] 目的：观察丹参多酚酸盐对月桂酸造成的血栓闭塞性肢端循环障碍动物模型的影响。

[0168] 受试药物

[0169] 使用按实施例1所制备的丹参多酚酸盐。[0170] 配制方法：丹参多酚酸盐用生理盐水配制成25和50mg/ml，临用时新鲜配制。[0171] 动物[0172] 来源，种属，品系：Wistar大鼠，中国科学院上海实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003，饲养合格证号：SYXK(沪)2003- 0029。

[0160]

体重：250-285g；[0174] 性别：♂；

[0173]

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CN 103980236 A[0175]

说 明 书

10/14页

动物总数：75只。

[0176] 试验方法

[0177] 将Wistar大鼠用2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg)，左下肢股内侧剪毛，75％酒精消毒皮肤，纵行切开约1.5cm长的切口，游离股动脉，用动脉夹阻断血液，在动脉夹下方向股动脉远心端注入0.12ml月桂酸溶液(月桂酸用生理盐水配成3mg/ml的溶液，然后用NaOH调节pH至8.0)，快速医用胶封闭针孔，1min后打开动脉夹，缝合皮肤。各组均于手术前0.5h给药，均皮下给药。以后每天给药一次，连续2周。观察造模后第四天，第七天及第十四天大鼠左肢坏疽病变程度和范围，并进行分级(0级：正常；I级：病变局限于趾甲部；II级：病变局限于趾部；III级：病变局限于足爪部；Ⅳ级：病变于膝关节以下；V级：病变发展到膝关节以上。实验数据用等级秩和进行显著性检验。[0178] 试验结果

[0179] 采用五级评分法分别在第四、第七和第十四天对大鼠肢端循环障碍肢体的变化进行观察评价，并在第十四天处死后，取患侧后肢进行组织病理学检查。结果显示：对照组大鼠肢端循环障碍肢体的评分在第四、第七和第十四天分别为35，53和55；丹参多酚酸盐25mg/kg组大鼠肢端循环障碍肢体的评分在第四、第七和第十四天分别为34，42和54；丹参多酚酸盐50mg/kg组大鼠肢端循环障碍肢体的评分在第四、第七和第十四天分别为17，30和26。各给药组的肢体评分较对照组均有改善，其中丹参多酚酸盐50mg/kg组大鼠肢端循环障碍肢体的评分在第四、第七和第十四天均显著改善(P<0.05)。详见表1，2，3和图4a-b，5a-b，其中图4a-b显示模型组大鼠患侧后肢动脉中有明显的血栓形成，图5a-b显示丹参多酚酸盐治疗组大鼠侧后肢动脉中无明显的血栓形成。

结论

[0181] 丹参多酚酸盐对大鼠肢端循环障碍模型具有治疗作用。

[0182] 表1丹参多酚酸盐对血栓闭塞性肢端循环障碍大鼠肢体病变4天分级的影响

[0180] [0183]

*P<0.05，**P<0.01vs生理盐水组

[0185] 表2丹参多酚酸盐对血栓闭塞性肢端循环障碍大鼠肢体病变7天分级的影响

[0184] [0186]

[0187] *P<0.05，**P<0.01vs生理盐水组

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CN 103980236 A[0188] [0189]

说 明 书

11/14页

表3丹参多酚酸盐对血栓闭塞性肢端循环障碍大鼠肢体病变14天分级的影响

*P<0.05，**P<0.01vs生理盐水组

[0191] 实施例5丹参多酚酸盐对大鼠微循环障碍模型的作用[0192] 目的：观察丹参多酚酸盐对大鼠微循环障碍模型的影响。[0193] 受试药物

[0194] 使用按照实施例1制备的丹参多酚酸盐。[0195] 配制方法：丹参酚盐注射液原料药用生理盐水分别配成5，10，20mg/ml，临用时新鲜配制。[0196] 动物[0197] 来源，种属，品系：Wistar大鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司公司提供。沪动合格字153号。[0198] 体重：160±20g；[0199] 性别：♂；[0200] 动物总数：44只。[0201] 试验方法

[0202] Wistar大鼠用1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉，从大鼠的股静脉注射试药，5min后，股静脉给平均分子量为50万高分子右旋糖苷(0.7ml/100g，右旋糖苷用生理盐水加热后溶解成10％浓度)。用生理盐水棉球将大鼠尾部中点测定部位的皮肤擦洗干净，取大鼠尾部中点，用激光多普勒血流计分别检测给右旋糖苷前，及给右旋糖苷后1min，5min，10min，20min，30min，45min，60min时皮肤的血流量。观察给右旋糖苷后大鼠尾部中点皮肤的血流量/给药前血流量的比值；观察时间为给右旋糖苷前，及给右旋糖苷后1min，5min，10min，20min，30min，45min，60min的血流量。实验数据用mean±SD表示，Studentttest进行显著性检验。[0203] 试验结果

[0204] 静脉注射给丹参多酚酸盐10mg/kg组，可见大鼠尾部血流量在5，10，20min时较生理盐水组显著增加(P<0.05或P<0.01)。当给药剂量为20mg/kg，大鼠尾部血流量在1，5，10，30，20，45和60min时均较生理盐水组显著增加(P<0.05或P<0.01)，详见表4。[0205] 结论

[0206] 丹参多酚酸盐可以明显改善右旋糖苷引起的大鼠微循环障碍。

[0190] [0207]

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CN 103980236 A

说 明 书

12/14页

实施例6丹参多酚酸盐对大鼠动静脉旁路血栓形成的抑制作用

[0209] 目的：观察大鼠舌下给丹参多酚酸盐后对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响。

[0208]

14

CN 103980236 A[0210] [0211] [0212] [0213] [0214]

说 明 书

13/14页

受试药物

使用按照实施例1制备的丹参多酚酸盐。配制方法：取丹参多酚酸盐，加蒸馏水溶解，临用时新鲜配制。动物来源，种属，品系：SD大鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司公司提供。沪动

合格字153号。

[0215] 体重：250-350g；[0216] 性别：♂；[0217] 动物总数：50只。[0218] 试验方法

[0219] (1)旁路塑管的制作：取二根6.5cm长内径1mm的聚乙烯塑管，中间穿入一根长6cm的丝线，其中一根塑管两端用长3公分，内径约0.8mm的聚乙烯塑管相连，另一根待用，管中充满50U/ml肝素钠生理盐水待用。

[0220] (2)实验选用体重250-350g雄性SD大鼠随即分成5个剂量组。大鼠用戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉大鼠仰卧固定在大鼠解剖板上，结扎食管，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。从大鼠股静脉注射50U/kg肝素钠生理盐水抗凝，然后将第一根塑料连接管两端分别插入右侧颈总动脉和左侧颈外静脉形成旁路。经舌下给药后30min时打开动脉夹，血液从右侧颈总动脉通过旁路塑管流入左侧颈外静脉，放开血流15min后中断血流迅速取出塑管内带血栓的丝线，吸走多余血液，称丝线湿重即30min血栓形成量。同时换取中间第二根塑管继续观察至60min再次打开动脉夹，放开血流15min后，称取60min时的丝线湿重，最后将空白对照组丝线湿重和给药组丝线湿重之比求出30min，60min时血栓形成抑制百分率并进行统计处理。舌下给药后30min和60min时血栓形成量。[0221] 试验结果

[0222] 丹参多酚酸盐25，50和100mg/kg舌下给药对大鼠动静脉旁路血栓形成有一定的抑制作用，舌下给药30min时其抑制率分别为28％，36％和 32％(P<0.01)。给药60min后，对血栓形成的抑制率分别为23％，37％和45％(P<0.01)。详见表5、6。[0223] 结论

[0224] 丹参多酚酸盐对大鼠动静脉旁路血栓形成具有抑制作用。

[0225] 表5丹酚酸盐舌下给药30min对大鼠动静脉旁路血栓形成的抑制作用

[0226]

*P<0.05，**P<0.01

[0228] 表6丹酚酸盐舌下给药60min对大鼠动静脉旁路血栓形成的抑制作用

[0227] [0229]

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说 明 书

14/14页

[0230] [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] *P<0.05.**P<0.01

实施例7丹参多酚酸盐对大鼠实验性棉球肉芽肿的作用目的：观察丹参酚酸盐对大鼠实验性棉球肉芽肿的影响。受试药物

使用按照实施例1制备的丹参多酚酸盐。配制方法：丹参多酚酸盐用生理盐水分别配成12.5，25和50mg/ml，临用时新鲜配

制。

动物

[0237] 来源，种属，品系：SD大鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司公司提供。沪动合格字153号。

[0236]

体重：173±32g；

[0239] 性别：♂；[0240] 动物总数：50只。[0241] 试验方法

[0242] 制备灭菌棉球重20.4mg，高压灭菌，各加入氨苄青霉素1mg/0.1ml，50℃烘箱烤干。SD大鼠在盐酸氯胺酮浅麻醉下，将两个灭菌棉球分别植入大鼠侧腋窝皮下，手术当天开始用药，连续七天，每天一次。第八天颈椎脱臼处死，取出棉球在60℃烤箱放置12小时后称重，减去原棉球重量，然后按体重折算成mg/100g即为肉芽肿的重量。给药七天后测定大鼠肉芽肿的重量。[0243] 试验结果

[0244] 丹参多酚酸盐25，50和100mg/kg皮下注射给药对大鼠实验性棉球肉芽肿形成有一定的抑制作用，抑制率分别为19％，23％和18％(均P<0.01)。详见表7。[0245] 结论

[0238]

丹参多酚酸盐对大鼠实验性棉球肉牙肿具有明显的抑制作用，表明该药有一定的

抗炎作用。

[0247] 表7丹参酚酸盐对大鼠实验性棉球肉芽肿形成的影响

[0246] [0248]

[0249] *P<0.05，**P<0.01。

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说 明 书 附 图

1/3页

图1

图2

图3

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说 明 书 附 图

2/3页

图4a

图4b

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说 明 书 附 图

3/3页

图5a

图5b

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