临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识

临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识

近年二代基因测序（ ，）技术快速发展，其应用已进展 至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾 病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。国内外有 关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用。中 华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期 组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在的 操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规 范在分子病理领域的应用。 临床分子病理实验室样本可采用甲醛固定石蜡包埋组织 （，）、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡 包埋标本和血浆 /血液标本等。 本共识特色是基于病理评估的 组织样本（、新鲜）的规范。测序分析范围基于目前临床需 求，本共识着重在于目标区域测序（）分析的实践。随着技 术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需 求。

一、实验室总体要求 检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室 建设指南（试行） 》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工 作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》 、《肿瘤个体化治 疗检测技术指南》 、《个体化医学检测实验室管理办法》 、《测 序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行） 》进行。

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检测人员的资质要求：检测技术人员应具备临床病理学、 分

子生物学的相关专业大专以上学历，并经过技术的理论与 技能培训合格。数据分析人员应具有临床医学或分子生物学 或遗传学知识背景并经生物信息学培训。最终报告应由中级 或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师 或者授权签字人（医学博士学位或高级职称）审核。

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检测实验室的区域设置要求：原则上实验室应当有以下分 区：

样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库 制备区、杂交捕获区 / 多重区域（第一扩增区） 、文库扩增区 （第二扩增区） 、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区。 各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因 扩增检验实验室工作导则》 。分区可根据实际情况合并，但 是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开。

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检测试剂及项目要求：试剂和测序平台均应选择中国食品 药

品监督管理总局（）认可产品。涉及到实验室自配试剂， 应该有严格的试剂制备标准操作规程（） ，需经过临床实验 室自建项目（）验证合格才可使用。每个检测项目在验证时 需要根据建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类 型包括，单碱基突变 ，、小片段插入或者缺失（） 、基因拷 贝数变异 （）、染色体结构变异， （）以及不同的样本类型 （如

组织、新鲜组织、全血、胸水等）对特定的准确性、精

确性、敏感性、特异性等性能参数进行验证。应该有经过标 准品测试的在不同的 （）下，不同测序深度的灵敏度及特 异性数据，确定不同样本的可信的测序深度。经验证后，发 生的任何改动，包括试剂、仪器、基因项目等都需要重新做 验证。验证实验结果签名留底备案。

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检测实验室的质量管理要求：检测主要包括实验操作和生 物

信息学分析两部分。实验操作部分包括样本准备、文库制 备、编码（）、目标区域富集、测序等；生物信息学分析部 分包括定位（） 、比对、变异识别、变异注释、变异解读及 报告等。上述流程均需要建立实验室质量管理体系文件和及 机器运行和维护，具有严格的室内质控措施；定期参加室间 质评以有及持续的质量保证和改进计划。

二、分析样本、基因和转运要求 分析样本类型可采用样本、新鲜组织、各种体液上清液、体 液离心细胞块石蜡包埋标本和血浆 / 血液标本等。 对于肿瘤体细胞变异初次检测应首选经病理评估的组织样 本，在此数据基础上的再次检测可选取液体样本动态监测。 检测前需通过病理诊断明确其肿瘤的性质及含量，根据不同 肿瘤类型选择合适的基因测序。 不同疾病的基因列表，必须由临床与检测机构的专家共同决 定，已达到不同实验室之间的可比性和完善性。 未经病理评估的基因检测结果不可单独用于分子病理临床

诊断目的。

样本质量对检测结果和分析至关重要，病理医师需要对可评 估的样本进一步明确病理诊断，并评价标本有无出血、坏死 和不利于核酸检测的前处理（例如含脱钙液处理） ，病变细 胞（如肿瘤细胞）的总量和比例，避免假阴性。组织标本中 肿瘤细胞含量建议达到 20%以上，低于此标准可富集后检测。 检测实验室应对不同类型的样本有采集及处理指导。对于不 同的样本（、体液、血液等）实验室应有不同的样本运送， 物流环节（含冷链运输）应有相关运送记录，确保样本运送 安全、无污染、无降解。

三、检测流程中的质量标准

1.

核酸提取及其质量分析：提取的核酸质量是检测成功的关 键

因素，在制备文库前应采用多种方法对核酸质量评估，包 括纯度、浓度和完整性分析。需要根据不同的样本类型制定 相应的用以鉴定核酸的纯度、浓度、完整性或降解程度等。 并对应明确接受和拒绝的标准。

2.

文库制备及其质量分析：文库制备方法主要有杂交捕获和 扩

增子建库，无论采用何种方法制备文库和平台检测，都应 对检测基因、 区域或突变热点进行描述， 并建立实验室检测。 建立好文库后上机测序前需对文库进行质量分析。每个检测 项目应设定其文库质量的要求，明确接受或拒绝的标准。

3 测序仪上机分析及其质量分析：建库主要有扩增法和捕获 法两大策略，测序时根据检测样本量和质量要求确定适当的 芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。录入样本编号、检 测内容、设定参数等信息，按仪器操作流程进行测序。产生 的测序数据质量参数要求详见后文。

4 检测中的样本追踪及对照设置： （ 1）样本追踪：为确保检 测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个位点或其他标签 作为样本身份标识（ ），在检测前对每个样本进行位点信息 的测定， 在检测后对上述位点进行追踪， 证明没有交叉污染

（2）阳性对照：应用组合型质控材料，可采用已知突变信 息的混合样本，以模拟样本的复杂性。实验时同时检测，以 确保其检出能力。 （ 3）阴性对照：用无核酸或明确无突变的 样本作为模板同时进行检测，以确保检测过程中没有污染或 非特异性。（ 4）应对方案和替代方法：各个质量控制步骤中 如出现异常或失败，实验室应有应对措施或备选方案；对于 测序结果质量差或有问题的区域应建立替代方法（如测序）

四、生物信息分析 数据的生物信息分析可分为两个主要步骤：一是对测序数据 进行质控分析及过滤。二是对通过质控的序列进行变异位点 鉴定分析并注释。所用各种生物信息分析软件，都要通过适 量标准品测序数据进行验证，证明所用软件及参数可达到临 床报告的要求。

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生物信息分析流程标准： （ 1 ）质控分析：为保证分析结

果 的可靠性，需要对原始的测序数据进行质量控制与过滤。测 序数据的质量控制主要包含 4 个方面：质量评估、去接头序 列、去低质量序列、去重复序列。 （ 2）序列比对（） ：将通 过质控后每一条与参考基因组进行比对，回贴到基因组上最 佳位置。（3）变异鉴定：对每个位点进行变异鉴定。在肿瘤 测序中，主要检测和两种突变类型，参数调整后可分析。部 分的设计还可以鉴定染色体易位。对于肿瘤基因测序数据， 鉴定后的变异位点都需要进行该位点可视化查看和确认，如 （）。（4）变异注释：基于通用数据库，对突变基因位点进 行功能注释，详见下文。

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生物信息分析流程质量管理：实验室应建立生物信息学程 序

的书面质量管理（） 计划文件。必须包含每次运行时监 测和评估运行性

能的指标和质控参数， 以及定期 （例如每月、 每季度）监测的指标和质控参数。指标和质控参数可包括但 不限于标准品的突变类型及百分比。生物信息分析流程建立 后，需要采用已知变异类型和变异频率的标准品进行验证， 验证其特异性和灵敏度是否达到实验室要求。验证结果签名 留底备案。（1）数据存储：实验室需要在生物信息分析过程 中对原始数据及最后的结果数据进行标准化存储，并要保存 相应的年限以备查。（ 2）版本可追溯性：每份病例数据分析 报告中，生物信息数据分析流程所涉及软件、算法、参数及 数据库的版本必须可溯源。 （ 3）异常记录。实验室需要建立 一个异常记录文档，用来记录偏离生物信息分析标准分析流 程的检测。

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生物信息分析质量指标：原始文件及比对结果文件的质量 指

标见表 1 。

表 14 数据存储格式标准：为了规范和管理各类数据，各个 实验室需按照编号进行数据管理，所有数据按照国际标准格 式进行存储。必须建立本地变异数据库（用于检验变异真实 性）。

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数据存储传输及共享安全标准：实验室需要制定规章制度 以

确认测序数据在内部及外部存储及传输过程中的安全性 和机密性。正常人群的变异数据应该共享。

五、结果解释及报告

1 临床报告包含内容：基于高通量测序技术，临床实验室比 较容易的获取更高通量的临床样本检测数据，不可避免会检 测到意义未知的变异位点，在实际工作中会有一定的不确定 性。但的检测报告建议体现以下内容：

（1）检测名称，如基因变异检测报告。

（2）患者基本信息，姓名，年龄，性别，住院号，送样医 院科室及医师等。

（3）样本信息，病理号，取材部位，样本类型（、新鲜、 血液等）、送检日期、报告日期等。

（4）病理信息，肿瘤组织类型、位置、分期、细胞含量、 肿瘤细胞比例、特殊说明（出血、坏死、酸脱钙处理等） 。

（5）检测技术，包含所用基因、检测平台名称，分析软件 版本号

等。

（6）结果列表应包含，基因名称、变异在染色体位置、变 异频率、的号（开头）及符合人类基因组变异协会（ ） 书写规范的突变类型、编码蛋白号（开头）及突变类型、杂 合/ 纯合状态等。

（7）临床意义解读和批注：体细胞突变，报告各个肿瘤检 测到的变异位点及临床意义。胚系突变，对于检测到的变异 位点的致病性予以相应的临床解释。临床意义解读要客观平 实的描述，在疾病相关性只描述既往研究中的疗效或预测， 不能出现使用何种治疗手段或策略的语言。

（8）若检测失败，应阐述失败原因。

（9）最终报告应由检测者、报告医师或指定审核人联合签 发。

2.基因变异的命名：在描述所检测出的基因变异时要遵循一 定的原则和规范，推荐使用人类基因组变异协会命名指南 （）。对于遗传病相关基因变异命名，推荐美国医学遗传学 学院（ ；）的遗传疾病变异分类指导的命名、遗传背景 说明以及权威文献说明。

3.

临床意义的解读和批注：对于肿瘤体细胞突变，根据突变 的

类型和已有的报道及指南，基因变异提倡分级的处理方

式：

A 级：美国食品药品管理局（）或中国食品药品管理局（） 批准的用药治疗靶点；写入中外诊疗指南有明确诊断

预后意义的变异。在报告注释该变异位点的临床诊断

预后意义的权威指南来源。

B 级：尚未进入诊疗指南，但已经写入该领域的专家共识的 变异位点。注释时要批注研究报道及专家共识的来源，明确 其药物及其临床意义、正在开展的状态等信息。

C 级：或批准用于其他肿瘤可预测疗效的基因变异，或者正 在进行中的临床试验变异位点。注释时要批注用于其他肿瘤 的权威指南，研究文献及临床试验正在开展的状态等信息。

D 级：处于学术争议或临床意义不明确的基因变异。同一实 验室应

该有统一的政策用来应对检测过程中出现的临床意 义不明变异情况。

对于以上几种情况在报告的时候注意客观平实地描述检测 的结果，在病理报告中不能出现建议使用何种治疗手段或策 略的语言。

对于遗传疾病（ ）检测，除了中外诊疗指南及重要参考文 献以外，推荐两个数据库： （）和美国医学遗传学学 院（）的遗传疾病变异分类指导注释临床意义，并附上数据 库和参考文献内容。遗传注释还可以参考各亚专科的专业数 据库进行注释（比如乳腺癌 1/2 基因等）。

4.

意义不明位点的处理：由于通量的增加和人种差异，临床 肿

瘤样本可能发现新的变异位点。实验室必须制定相关政策 方案用来应对检测过程中出现的临床意义不明变异情况。政 策可以是一发现变异就报告，但附上说明和意义。也可以是 不报道这些发现或只报道小部分变异结果，并附上说明和参 考文献及数据库。但是在报告的备注里一定要声明本实验室 的报告规则。

5.

知情同意：建议提供患者手写或在线版的知情书。