(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104122394 A(43)申请公布日 2014.10.29
(21)申请号 201310140596.0(22)申请日 2013.04.23
(71)申请人北京豪迈生物工程有限公司
地址100007 北京市东城区板桥胡同4号(72)发明人鄢盛恺(51)Int.Cl.
G01N 33/577(2006.01)G01N 33/531(2006.01)G01N 21/76(2006.01)
权利要求书4页 说明书7页权利要求书4页 说明书7页
(54)发明名称
人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法(57)摘要
一种人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球；所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法。CN 104122394 ACN 104122394 A
权 利 要 求 书
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1.人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在于：包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球；所述的试剂1匙含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液；所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\\-20)和Proclin-300的缓冲液。
2.按照权利要求1所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在于：所述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成：
(1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中，称取4g吐温20(TWEEN-20)，加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
(3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间；(4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素1g，全部倒入上述容器中，充分混匀；
(5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得到免疫磁珠缓冲液，备用；
(6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中，备用；取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml，获得一级抗体溶液，用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；
(7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中，在3000g下离心30min，浓缩至0.5ml，获得三级抗体溶液；
(8)、取0.5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠；
(9)、加入0.3ml1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒；
(10)、用10ml PH7.20.1mol/LPB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶；(11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒；
(12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为0.05％的标准浓度磁珠使用液；
(13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025％)；
所述试剂1采用如下步骤制成：
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(1)、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl2、0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解；
(2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.35-7.45范围内；(3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中；(4)、最后用纯化水定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得试剂1稀释液，备用；(5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升，获得浓缩液；
(6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；
(7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH1溶液，混匀，置4℃下2小时；
(8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液：(9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中，获得溶液；
(1())、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时，去除铵离了，收集保留液后10,0000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1体积的上清液：100体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀，即得试剂1。
所述试剂2采用如下步骤制成：(1)、取TRIS1.56g、NaCl4.23g和0.5g甲基纤维素，全部加入容器中，取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中；
(2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；
(3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33，称取牛γ－球蛋白(lgG)20g，羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得试剂2；
所述稀释液采用如下步骤制成：(1)、称取NaCl9.0g和BSA60g，加入容器中；(2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中；(3)、最后加纯化水定容1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得稀释液；所述清洗浓缩液采用如下步骤制成：(1)、取TRIS12.54g和NaCl325.6g，加入容器中；(2)、取5gTween-20，加20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中；(3)、取0.2ml Proclin-300，用10ml纯化水完全溶解后，加入步骤2容器中；(4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中，充分搅拌，直至其中的固体物完全溶解；
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(5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；(6)、最后用纯化水定容1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，即得清洗浓缩液：所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成：(1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml，加入烧杯中；
(2)、加入600ml纯化水于烧杯中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；
(3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480，用纯化水定容至1000ml，混匀后用0.2μm滤器过滤，即得酶促化学发光底物溶液。
3.按照权利要求2所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在于：所述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml；所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
4.按照权利要求3所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在于：所述室温反应的温度为20℃-24℃。
5.人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本；2)、向每一试管中加入45μl试剂1；3)、向每一试管中加入45μl试剂2；4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂；5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，将试管架连同全部试管置于水浴箱中，温浴45分钟；
6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液：7体积纯化水的比例添加纯化水，得到清洗液，向每一试管中加200μl清洗液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；
8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30杪；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；
10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中，混匀5秒，迅速用准备好的发光检测
即可得到相关数据。仪进行检测，
6.按照权利要求5所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方
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法，其特征在于：所述待测标本为高值HOOK样本时，使用稀释液对标本进行稀释。
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人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测
方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是人表皮生长因子受体
2(HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002] 表皮生长因子受体(epidermal growth Tactor receptor，缩写EGFR)是ErbB家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后，启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成和恶化密切相关。[0003] 目前乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤，也是常见的女性肿瘤死亡原因之一。大约有20％～30％的乳腺癌患者HER-2/neu高表达，HER-2/neu高表达与患者的不良预后密切相关。HER-2/neu基因是人表皮生长因子家族的第2位成员。定位于染色体17q21，其编码一种分子量为185ku的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，结构上分为膜外配体结合域、跨膜区和膜内酪氨酸激酶的活性域。HER-2/neu蛋白的胞外部分可以从细胞的表面脱落至血液中，形成分子量大约为105ku的可溶性蛋白HER-ZECD。HER-ZECD的裂解启动了细胞膜上的受体磷酸化，从而激活了细胞核内her-2并导致基因转录、细胞增殖；或ECD裂解后，截短的细胞内酪氨酸激酶保持信号传导能力，相应的实验结果认为ECD的裂解会使细胞膜上的p95发生磷酸化，从而导致肿瘤细胞的增殖。发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法。[0005] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球：所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液；所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\\-20)和Proclin-300的缓冲液。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述HER-2磁分
离试剂采用如下步骤制成：[0007] (1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中，称取4g吐温20(TWEEN-20)，加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；[0008] (2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒
[0006]
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入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；[0009] (3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间；[0010] (4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素1g，全部倒入上述容器中，充分混匀；[0011] (5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得到免疫磁珠缓冲液，备用；[0012] (6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中，备用；取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml，获得一级抗体溶液，用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；[0013] (7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中，在3000g下离心30min，浓缩至0.5ml，获得三级抗体溶液；[0014] (8)、取0.5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠；[0015] (9)、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒；[0016] (10)、用10ml PH7.2 0.1mol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶；
[0017] (11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒；[0018] (12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为0.05％的标准浓度磁珠使用液；[0019] (13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025％)；[0020] 所述试剂1采用如下步骤制成：[0021] (1)、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解；[0022] (2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.35-7.45范围内；[0023] (3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中；[0024] (4)、最后用纯化水定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得试剂1稀释液，备用；
[0025] (5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升，获得浓缩液；[0026] (6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；[0027] (7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液，
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混匀，置4℃下2小时；[0028] (8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；
[0029] (9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中，获得溶液；[0030] (10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时，去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1体积的上清液：100体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克降抗体的偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀，即得试剂1。
[0031] 所述试剂2采用如下步骤制成：[0032] (1)、取TRIS1.56g、NaCl4.23g和0.5g甲基纤维素，全部加入容器中，取0.2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中；[0033] (2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；[0034] (3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33，称取牛γ球蛋白(1gG)20g，羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得试剂2；
[0035] 所述稀释液采用如下步骤制成：[0036] (1)、称取NaCl9.0g和BSA60g，加入容器中；[0037] (2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中；[0038] (3)、最后加纯化水定容1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得稀释液；所述清洗浓缩液采用如下步骤制成：[0039] (1)、取TRIS12.54g和NaCl325.6g，加入容器中；[0040] (2)、取5g Tween-20，加20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中；[0041] (3)、取0.2ml Proclin-300，用10ml纯化水完全溶解后，加入步骤2容器中；[0042] (4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中，充分搅拌，直至其中的固体物完全溶解；[0043] (5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；[0044] (6)、最后用纯化水定容1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，即得清洗浓缩液；[0045] 所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成：[0046] (1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml，加入烧杯中；[0047] (2)、加入600ml纯化水于烧杯中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；[0048] (3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480，用纯化水定容至1000ml，混匀后用0.2μm滤器过滤，即得酶促化学发光底物溶液。
[0049] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述HER-2校准
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品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml；所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
[0050] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述室温反应的温度为20℃-24℃。
[0051] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：[0052] 1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本；[0053] 2)、向每一试管中加入45μl试剂1；[0054] 3)、向每一试管中加入45μl试剂2；[0055] 4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂；[0056] 5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，将试管架连同全部试管置于水浴箱中，温浴45分钟；[0057] 6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液：7体积纯化水的比例添加纯化水，得到清洗液，向每一试管中加200μl清洗液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；[0059] 8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；[0060] 9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；[0061] 10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；[0062] 11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中，混匀5秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测，即可得到相关数据。
[0063] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，其中所述待测标本为高值HOOK样本时，使用稀释液对标本进行稀释。
[0064] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法，其试剂盒包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；实验表明，本发明的人表皮生长因子受体2也即癌胚抗原(HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法，具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
[0065] 下面对本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法作进一步详细说明。
[0058]
具体实施方式
9
CN 104122394 A[0066]
说 明 书
5/7页
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，包括HER-2磁分离试
剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球；所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克降抗体；所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液；所述消洗浓缩液是含有吐温-20(TWEEN-20)和Proclin-300的缓冲液。
[0067] 上述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成：[0068] (1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中，称取4g吐温20(TWEEN-20)，加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；[0069] (2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；[0070] (3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间；[0071] (4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素1g，全部倒入上述容器中，充分混匀；[0072] (5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得到免疫磁珠缓冲液，备用；[0073] (6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中，备用；取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml，获得一级抗体溶液，用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；[0074] (7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中，在3000g下离心30min，浓缩至0.5ml，获得三级抗体溶液；[0075] (8)、取0.5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠；[0076] (9)、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒；
[0077]
(10)、用10ml PH7.2 0.1mol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃
瓶；
(11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒；[0079] (12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为0.05％的标准浓度磁珠使用液；[0080] (13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025％)；[0081] 所述试剂1采用如下步骤制成：
[0078]
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CN 104122394 A[0082]
说 明 书
6/7页
(1)、取Tris6.0６g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g
于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完仝溶解：[0083] (2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.35-7.45范围内：[0084] (3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中；[0085] (4)、最后用纯化水定容至1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，得试剂1稀释液，备用：
[0086] (5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升，获得浓缩液；[0087] (6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液：[0088] (7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/mlNaBH；溶液，混匀，置4℃下2小时：[0089] (8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；
(9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后
3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中，获得溶液；[0091] (10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时，去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1体积的上清液：100体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀，即得试剂1。
[0092] 所述试剂2采用如下步骤制成：[0093] (1)、取TRIS1.56g、NaCl 4.23g和0.5g甲基纤维素，全部加入容器中，取0.2mlProclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中；[0094] (2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；[0095] (3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33，称取牛γ-球蛋白(1gG)20g，羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得试剂2：
[0096] 所述稀释液采用如下步骤制成：[0097] (1)、称取NaCl9.0g和BSA60g，加入容器中：[0098] (2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中；[0099] (3)、最后加纯化水定容1000ml，完全溶解后，用0.2μm滤器过滤，即得稀释液：
[0090]
所述清洗浓缩液采用如下步骤制成：[0101] (1)、取TR1S12.54g和NaCl325.6g，加入容器中；[0102] (2)、取5gTween-20，加20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中；
[0100]
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CN 104122394 A[0103]
说 明 书
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(3)、取0.2ml Proclin-300，用10ml纯化水完全溶解后，加入步骤2容器中；
[0104] (4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中，充分搅拌，直至其中的固体物完全溶解；[0105] (5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；[0106] (6)、最后用纯化水定容1000ml，用0.2μ μm滤器过滤，即得清洗浓缩液；[0107] 所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成：[0108] (1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml，加入烧杯中；[0109] (2)、加入600ml纯化水于烧杯中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；[0110] (3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480，用纯化水定容至1000ml，混匀后用0.2μm滤器过滤，即得酶促化学发光底物溶液。
[0111] 上述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml；所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。[0112] 上述室温反应的温度为20℃-24℃。
[0113] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，其包括如下步骤：
1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本；
[0115] 2)、向每一试管中加入45μl试剂1；[0116] 3)、向每一试管中加入45μl试剂2；[0117] 4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂；[0118] 5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，将试管架连同全部试管置于水浴箱中，温浴45分钟；[0119] 6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；[0120] 7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液：7体积纯化水的比例添加纯化水，得到清洗液，向每一试管中加200μl清洗液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；[0121] 8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；[0122] 9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；[0123] 10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
[0114]
11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中，混匀5秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测，即可得到相关数据。
[0125] 上述待测标本为高值HOOK样本时，使用稀释液对标本进行稀释。
[0124]
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