青蒿素对肿瘤坏死因子α介导的REIC表达相关平滑肌增殖的影响

影响

曹乾;陈洁;姜艳;刘雪

【摘 要】目的 探讨青蒿素(ART)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的细胞永生化表达下调(REIC)表达相关平滑肌增殖的影响.方法 将大鼠随机分为假手术组、模型组、50 mg/kg ART组和100 mg/kg ART组.建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,分离血管平滑肌细胞进行培养.Western blot检测REIC表达,荧光定量PCR检测引物.结果 大鼠颈动脉球囊损伤后,REIC基因表达受到抑制,ART处理对大鼠动脉平滑肌细胞中REIC蛋白的表达影响极小.而TNF-α处理下细胞中REIC蛋白的表达水平受到显著抑制.ART对细胞进行预处理,能够显著减轻TNF-α导致的REIC蛋白表达抑制.而ART处理呈剂量依赖性上调REIC的表达.结论 REIC表达通过TNF-α介导参与平滑肌增殖过程,而且应用ART可以抑制平滑肌增殖过程. 【期刊名称】《中国医科大学学报》 【年(卷),期】2016(045)001 【总页数】5页(P26-30)

【关键词】青蒿素;大鼠颈动脉球囊损伤模型;细胞永生化表达下调;肿瘤坏死因子 【作 者】曹乾;陈洁;姜艳;刘雪

【作者单位】中国医科大学附属盛京医院心内科,沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院心内科,沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院急诊科,沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院心内科,沈阳110004

【正文语种】中 文 【中图分类】R331.3 网络出版地址

重点临床科室诊疗能力建设项目（LNCCC⁃D10⁃2015） E-mail：*************网络出版时间：

Abstract Objective To explore the influence of artemisinine（ART）on smooth muscle proliferation related to reduced expression of immortal⁃ized cells（REIC）induced by tumor necrosis factor α（TNF⁃α）.Methods Rats were randomly divided into sham⁃operated group，model group，50 mg/kg ART group，and 100 mg/kg ART group.Balloon⁃damaged rat carotid artery models were

established.Vascular smooth muscle cells were isolated and cultured.REIC protein and mRNA expression were detected by Western blot and fluorescent quantitation PCR.Results The expres⁃sion of REICgenes was suppressed when carotid arteries were balloon⁃damaged.Vascular smooth muscle cells，intervened with ART，minimally af⁃fected

REICproteinexpressioninratarterialsmoothmusclecells.Whiletreatedwith TNF⁃α，thelevelofcellularexpressionof REICproteinwassig⁃nificantly restrained.Preconditioning of ART on cells would prominently ameliorate the TNF⁃α⁃induced suppression of REIC protein expression and unregulated REICexpressioninadose⁃dependentmanner.Conclusion REICisinvolvedintheprocessof

TNF⁃α⁃inducedsmoothmuscleprolifer⁃ation.ARTiscapableofsuppressingproliferativeprocessofsmoothmusclecells.

Keywords artemisinine；balloon⁃damaged rat carotid artery；reduced expression of immortalized cells；tumor necrosis factor α

各种理化因素导致的损伤可以诱导炎症过程、氧化应激加强，通过原癌、抑癌基因表达失调，使平滑肌增殖、迁移，进而动脉增殖加速，这是动脉粥样硬化发生的主要机制。近几年肿瘤领域有关细胞永生化表达下调（reduced expression in immortalized cells，REIC）研究的报道很多，但是其与动脉粥样硬化的关系还不清楚。因此，探讨REIC与平滑肌增殖关系、明确REIC表达意义及其与氧化和炎症的关系有重要意义，可以为研究动脉粥样硬化提供理论依据。通过干预细胞内信号转导通路和/或调节相关基因的表达以阻断血管平滑肌细胞增殖，可望成为治疗心血管疾病的有效途径。青蒿素（artemisinin，ART）又名黄花蒿素，是由菊科植物黄花蒿提炼出来的倍半萜内酯化合物，是治疗恶性疟原虫所引发的疟疾的特效药［1］。近来研究发现，ART还具有广谱的生物学和药理学活性，如抗肿瘤［2］、抗炎［3］、抗氧化［4］等。本研究通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型以及大鼠动脉血管平滑肌细胞的培养，应用ART、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）对细胞进行预处理，采用实时荧光定量PCR分析REIC基因的表达水平，Western blot分析REIC蛋白的表达水平，为上述问题提供证据支持。

1.1 大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立

选取健康SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、50 mg/kg ART组和100 mg/kg ART组。模型组、50 mg/kg ART组和100 mg/kg ART组大鼠行颈外动脉切开，行球囊剥脱内膜。假手术组经同样处理但不进行球囊损伤。建模后，50 mg/kg ART组和100 mg/kg ART组大鼠每天经灌胃分别给予50 mg/kg ART

和100 mg/kg ART，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。 1.2 大鼠动脉血管平滑肌细胞的分离与培养

处死大鼠，取动脉内膜剪成小块，于培养瓶底部进行培养。12 h后加入完全培养基，进行细胞计数，放置到培养板中培养。第1代细胞生长至5～6 d时，进行传代处理，收集、离心、去上清，进行细胞计数，接种培养。

模型组细胞分为6组，分别做以下处理，用于后续试验：A组，不做任何处理；B组，用100 μmol/L ART处理细胞2 h；C组，用10 ng/mL TNF⁃α处理细胞24 h；D组，用25 μmol/L ART处理细胞2 h，再用10 ng/mL TNF⁃α处理细胞24 h；E组，用50 μmol/L ART处理细胞2 h，再用10 ng/mL TNF⁃α处理细胞24 h；F组，用100 μmol/L ART处理细胞2 h，再用10 ng/mL TNF⁃α处理细胞24 h。

1.3 蛋白质抽提测定

1.3.1 抽提蛋白及定量：制备标准曲线后，将抽提的蛋白待测样本1 μL与19 μL PBS缓冲液混匀，加入各孔中吹打混匀。以标准蛋白浓度及对应吸光值绘制标准曲线，通过回归方程计算样本蛋白浓度。

1.3.2 SDS⁃PAGE：根据目的蛋白分子量选用对应浓度的聚丙烯酰胺凝胶。先后灌入分离胶、浓缩胶，封口，等待上样。稀释蛋白样品后在沸水浴中煮沸，制成上样液。电泳槽每孔加入20 μL电泳上样液进行电泳。

1.3.3 转印封闭，孵育一抗、二抗：电泳结束后，剥落凝胶。在转印夹负极一侧铺海绵、滤纸、凝胶，之后浸于转印缓冲液中的PVDF膜，膜的正面与凝胶接触，在PVDF上面铺上滤纸和海绵，进行转印。转印结束后取出PVDF膜，TTBS冲洗后，浸入脱脂奶粉溶液中。用脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液，倒入杂交袋中，放入PVDF膜，进行抗体孵育。同样进行二抗孵育。

1.3.4 ECL底物发光，抗体剥脱封闭：取出孵育二抗后的PVDF膜进行曝光后加

入剥脱液，再浸入脱脂奶粉溶液中。

1.3.5 孵育内参抗体、二抗：同样方法孵育内参抗体及二抗后ECL底物发光。 1.3.6 结果分析：将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统（Gel⁃Pro⁃Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。 1.4 荧光定量PCR

1.4.1 总RNA提取：样本中加入裂解液、氯仿，振荡离心，吸附柱吸附，离心。 1.4.2 反转录：将RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA，样本上样量（μL）与ddH2O使用量（μL）如下：A组，3.8、6.7；B组，5.2、5.3；C组，4.5、6.0；D组，3.4、7.1；E组，3.3、7.2；F组，5.5、5.0。在无核酸酶的离心管中加入反应混合物，混匀，加热终止反应。以上步骤由PCR仪完成，最后得到20 μL cDNA样本。

1.4.3 实时荧光定量分析：稀释引物，引物信息见表1。反应体系为cDNA模板1 μL；上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL；SYBR GREEN mastermix 10 μL；用ddH2O补足至20 μL。分别以不同反应条件反应40次。 1.5 免疫荧光染色及镜检

固定细胞爬片，将爬片倒扣在载玻片上封片。于激光共聚焦显微镜下观察。于镜下（400×）拍照。1.6 REIC表达和引物序列检测

1.6.1 Western blot检测REIC表达：一抗为REIC抗体，内参抗体为β⁃actin抗体，二抗为羊抗兔IgG⁃HRP。

1.6.2 荧光定量PCR检测引物序列：REIC（NM_ 138519.2），F，CAACTACCACAACGAGACCAA；R，ATGGCTCTTCTTGCCTTCT。β⁃actin（NM_031144.3），F，GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC；R，GGCCG⁃GACTCATCGTACTCCTGCTT。 1.7 RNA浓度测定

RNA提取后利用紫外分光光度计用实时荧光定量分析方法（2-△△CT方法）对提取的RNA浓进行测定。结果提示A组～F组核酸浓度（ng/μL）分别为263.5、193.5、220.7、291.5、304.6、182.1，A组～F组吸光度比值（260/280）分别为1.82、1.83、1.93、1.96、1.99、1.81。本研究中每种样本每个基因进行复孔平行实验，舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据。 1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，应用Bonferroni法进行多重比较，应用方差分析进行单因素分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2.1 大鼠动脉平滑肌细胞显微形态学观察及鉴定

细胞形体多呈长梭形，核大，有明显的肌丝纤维，细胞呈典型“峰－谷”状生长。见图1。

免疫荧光双标染色显示，与细胞长轴平行的绿色部分为α平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle actin，α⁃SMA），蓝色部分为细胞核。胞质中α⁃SMA呈阳性表达，证明分离的细胞为大鼠动脉平滑肌细胞。见图2。 2.2实时荧光定量PCR分析REIC基因的表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠颈动脉中REIC mRNA水平显著降低（P< 0.01）。50 mg/kg ART组及100 mg/kg ART组大鼠颈动脉中REIC的表达与模型组比较显著升高（P< 0.05）。

模型组中，B组细胞中REIC基因的表达无显著变化，C组细胞中REIC基因的表达受到显著抑制。D组、E组及F组中可以观察到，不同浓度的ART对细胞进行预处理，能够呈剂量依赖性减轻TNF⁃α对REIC基因表达的抑制。见图3。 2.3 Western blot分析REIC蛋白的表达水平

与假手术组相比，模型组大鼠颈动脉中REIC蛋白水平显著降低（P< 0.01）。在

50 mg/kg ART组及100 mg/kg ART组大鼠颈动脉中，REIC蛋白水平的表达与模型组相比显著升高（P< 0.05）。见图4。

模型组中，B组细胞中REIC蛋白的表达无显著变化，C组细胞中REIC蛋白的表达水平受到显著抑制。D组、E组及F组中可以观察到，ART能够显著减轻TNF⁃α导致的REIC蛋白表达抑制，且ART的作用呈剂量依赖性。见图5。 动脉粥样硬化是一种主要侵害大、中动脉，使血管内膜增厚、变硬、管腔狭窄的慢性动脉疾病。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的活化、增殖和迁移是动脉粥样硬化发展的必要条件，有炎性反应参与，有研究表明可能是通过上调炎性细胞因子及下调抗炎细胞因子的表达参与动脉粥样硬化的形成［5］。在生理状态下，VSMCs合成分泌胶原等细胞外基质维持血管的正常结构和功能。但是粥样斑块形成早期，VSMCs从血管中膜迁移至内膜，进而增殖并发生表型变化，合成分泌细胞外基质、释放多种生长因子，如TNF⁃α等［6，7］。动脉粥样硬化的平滑肌增殖过程，与肿瘤类似。某种基因低表达可以促使细胞永生化，即抑癌基因。一些原癌、抑癌基因由于参与调控内皮细胞、平滑肌增生与凋亡，在动脉粥样硬化中也起到关键作用。Tsuji等［8］从几种永生化细胞系中发现一段新的基因序列REIC表达明显下调。REIC基因在永生化的细胞系和部分肿瘤细胞系中被发现，在心、脑和脊髓高表达。近年来对REIC基因在肿瘤方面有所研究，认为与新生血管数量、平滑肌细胞明显增殖、内皮细胞功能有关。但是REIC基因与动脉粥样硬化的关系少有研究。因此研究调控VSMCs的增殖和迁移的机制，寻找能够调控VSMCs的增殖和迁移的药物，对于开发新的有效的动脉粥样硬化的治疗方法具有重要意义。

血管壁受损是导致血管平滑肌细胞增殖的起始原因。损伤刺激通过细胞内的信号转导可引起许多原癌基因的表达和细胞因子生成，使血管平滑肌细胞增殖和凋亡的平衡被打破，导致血管平滑肌细胞过度增殖［9］。本研究中与假手术组相比，模型

组大鼠颈动脉中REICmRNA水平显著降低，而在50 mg/kg ART组及100 mg/kg ART组大鼠颈动脉中，REIC的表达比模型组显著升高。反映球囊损伤后，REIC基因表达受到抑制，平滑肌增殖明显，而ART处理能够呈剂量依赖性上调REIC的表达，对抗增殖。对于培养的大鼠动脉平滑细胞，100 μmol/L ART处理后无论REIC的基因表达还是蛋白表达并无显著变化，可能与缺少作用关键环节有关。而10 ng/mL的TNF⁃α能够显著抑制细胞中REIC基因的表达水平和蛋白合成。使用25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L ART对细胞进行预处理，能够呈剂量依赖性减轻TNF⁃α对REIC基因表达和蛋白合成的抑制。说明在平滑肌增殖过程中TNF⁃α起到重要作用，对于大鼠损伤动脉的平滑肌增殖，不同浓度ART通过TNF⁃α介导的REIC表达抑制起到抑制受损的平滑肌增殖作用。

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