第４４卷第３期 ２０１３年３月 东北农业大学学报 ４４（３）：７２－７８ ＭａＴ．２０１３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析 刘胜旺Ｌ ，张碉 ，刘晓丽 ，李云霞 ，韩宗玺 ，邵昱昊 ，孔宪刚 （１．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０￣２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽病研究室，哈尔滨１５０００１） 摘要：２０１０年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病，通过对来自山东某发病鸭 场的病料进行分离，得到实验室分离株Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８。对其进行全基因组序列测定分析，确定该株病毒全基 因组合有一个开放阅读框，编码一个由３ ４２６个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Ｄｌｌ，ｃＨ，ＬＳＤ／１１０１２８株与黄 热病毒（Ｙｅｌｌｏｗｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、登革热病毒（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、伊利乌斯脑炎病毒（Ｉｌｈｅｕｓ ｖｉｒｕｓ）、西尼罗病毒（ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、巴格扎病毒（Ｂａｇａｚａｖｉｒｕｓ）和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析，发 现Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上，与其他株坦布苏病毒核酸同源性在 ８７％以上，可以确定Ｄｕ／ＣＩ－Ｉ／ＬＳＤ／１１０１２８株属于新型鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ）。 关键词：鸭坦布苏病毒；分离鉴定；基因组；分离鉴定 中图分类号：Ｑ９５—３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３６９（２０１３）０３—００７２—０７ 刘胜旺，张硐，刘晓丽，等．一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析【Ｊ】．东北农业大学学报，２０１３，４４（３）：７２－７８． Ｌｉｕ Ｓｈｅｎｇｗａｎｇ．Ｚｈａｎｇ Ｙｕｅ，Ｌｉｕ Ｘｉａｏｌｉ。ｅｔ ａ１．ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮｏＲｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１ ３，４４（３）：７２－７８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｌｉｓｈ ａｂｓｔｒａｃｔ） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ／ｕｕ Ｓｈｅｎｇｗａｎｇ ２１ ＺＨＡＮＧ Ｙｕｅ’，ＬＩＵ Ｘｉａｏｌｉ ，ＬＩ Ｙｕｎｘｉ＆，ＨＡＮ Ｚｏｎｇｘｉ ，ＳＨＡＯ Ｙｕｈａｏ２，ＫＯＮＧ Ｘｉａｎｇａｎｇ （１． ＳｃｈｏｏＩ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒ１）ｉｎ １ ５００３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｈａｒ１）ｉｎ Ｖｅｔｅｄｎａ￣Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ １ ５０００１， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ２０１ ０ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，ｗｉｔｈ ａ ｓｅｖｅｒｅ ｄｒｏｐ ｉｎ ｅｇｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ａ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒ０ｍ ｔｈｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｄｕｃｋｓ ｆｒ０ｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｉｔ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｓ ａ Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ（ＤＴＭＵＶ）．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＤＴＭＵＶ ｎａｍｅｄ ＤｕｌＣＨＩＬＳＤＩ１ １ ０１ ２８．ＤｕｌＣＨＩＬＳＤＩ１ １ ０１ ２８ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ ３ ４２６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ＤｕｌＣＨＩＬＳＤＩ１ １ ０１ ２８ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｌｆａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ，Ｉｌｈｅｕｓ ｖｉｒｕｓ，Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ，Ｂａｇａｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１ １ ０１ ２８ ｓｔｒａｉｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ Ｂａｇａｚａ ｖｉｒｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｔｉｒｅ ＯＲＦ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ＤｕｌＣＨＩＬＳＤＩ１ １ ０１ ２８ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｓ ａ ｎｅｗ ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＤＴＭＵＶ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｇｅｎｏｍｅ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｎｔｉｆａｃａｔｉｏｎ 收稿日期：２０１２—１０—２４ 基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（２０１２０３０５６） 作者简介：刘胜旺（１９６９一），男，研究员，博士生导师，研究方向为分子病毒学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｗｌｉｕ＠ｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ 第３期 刘胜旺等：一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析 ２０１０年初，在我国南方集中养鸭地区出现一 ＰＢＳ匀浆，一７０℃反复冻融３次，８ ０００ ｒ・ａｒｉｎ 离心 种引起蛋鸭产蛋量下降的疾病。该病迅速传播， 在国内其他养鸭地区鸭场相继出现，涉及福建、 浙江、广西、广东、江苏、江西、安徽、河南、 河北、北京、山东等地。该病导致鸭、蛋鸭产蛋 ５ ｍｉｎ，吸取上清液，用０．２２ ｔｘｍｏｌ・ＩＪ－ 一次性滤器 过滤除菌后将滤液装于冻存管中备用。将滤液以 ０．１ ｍＬ・胚～，接种于－１１日龄ＳＰＦ鸭胚，３７ ｃＩ＝孵 育，弃掉２４ ｈ以内死亡胚，７２ ｈ后将接种鸭胚放入 ４ ｏＣ，１ ｈ后无菌收取尿囊液。 １．４全基因序列测定分析 １．４．１ 引物的设计合成 量大幅度下降，肉鸭、育成鸭发生神经症状，给 我国养鸭业造成巨大经济损失。经研究确定该病 是由一种新的黄病毒感染引起。这种新的黄病毒 隶属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒的恩塔亚 根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的鸭黄病毒ＢＹＤ一１株（登 病毒群，和坦布苏病毒亲缘关系最近，确定为一 种新型鸭黄病毒一鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴＭＵＶ）ｃ卜 。２０１ １年中国畜牧兽医学会第一 届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布 苏病毒病”。 鸭坦布苏病毒（ＤＴＭＵＶ）的病毒粒子呈球形， ４５～５０ ｒｉｍ之间，有囊膜，表面有纤突 ， ’７１０基因 组为单股正链ＲＮＡ，含有一个开放阅读框，编 码顺序为５’ＵＴＲ—Ｃ—ＰｒＭ—Ｅ—ＮＳ１一ＮＳ２Ａ—ＮＳ２Ｂ—ＮＳ３一 ＮＳ４Ａ—ＮＳ４Ｂ—ＮＳ５一ＵＴＲ３’。其中有３种结构蛋白 Ｃ、ＰｒＭ、Ｅ和７种非结构蛋白ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、 ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５。 本研究对病料进行病毒分离，全基因测序。 国际上通常以黄病毒ＮＳ５基因３’端长约１ ｋｂ的区域 同源性作为黄病毒属病毒分类依据。通过对实验 室分离株Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１ １０１２８株全基因和ＮＳ５基因 对比分析，确定该株病毒属于新型鸭坦布苏病毒 （ＤＴＭＵＶ）。 １ 材料与方法 １．１病料来源主要材料 病料来自山东某发病鸭场；ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ—ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、ｐＭＤ１８一Ｔ载体、２５０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ以及３＇ＲＡＣＥ快速扩增试剂盒等 （购自宝生物工程（大连）有限公司）；ＤＮＡ回收试剂 盒（购自ＯＭＥＧＡ公司）；０．２２ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ～一次性滤器 （购自Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；其他化学试剂均为国产分析 纯；大肠埃希氏工程菌ＪＭ１０９由本实验室保存。 ｌ－２动物 ＳＰＦ鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究 所实验动物中心。 １．３病毒分离 对来自山东某发病鸭场病料进行研磨，加入 录号：ＪＦ３１２９１２）的序列口’ ，及参考文献［１５］设计１０ 对包含１Ｏ条互相重叠片段的引物（见表１），由北京 六合华大基因科技股份有限公司构建。 表１扩增引物 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｉｎ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ 徘 Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５『ｔ０３’） Ｆ： ‘ ｅ １．４．２病毒ＲＮＡ的提取 对收取的尿囊液进行病毒ＲＮＡ提取，取２００ 鸭胚尿囊液，按ＲＮＡｉｓｏ说明书提取ＲＮＡ，最 后用３Ｏ ＤＥＰＣ水溶解沉淀。通过ＲＴ—ＰＣＲ方 法判定病毒分离是否成功。引物使用鸭黄病毒 （Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）的特异性引物，ＤＦＬＡ—Ｆ：ＡＧＡＣＴＧＣＴＧ ＧＴＧＣＡＡＴＧＡＧＡＣ和ＤＦＬＡ—Ｒ：ＣＧＴＣ ＧｒｒｒＣＣＣＡＧＡＴ ＴＣＣＡ“ 。预期扩增片段长度２５０ ｂｐ，ＲＴ—ＰＣＲ产物 经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测。 ・７４・ 东北农业大学学报 第４４卷 １．４－３病毒全基因组克隆 行拼接分析，所得序列在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ 同源序列比对，用ＭＥＧＡ５软件采用邻近法分别 对Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８株与其他黄病毒科病毒进 行全基因发育进化树和ＮＳ５基因发育进化树 构建。并用ＭｅｇＡｌｉｇｎ对全基因组和ＮＳ５基因进行 将经琼脂糖凝胶电泳检测阳性病毒ＲＮＡ使用 已设计的１Ｏ对引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，产物根据 ＯＭＥＧＡ公司胶回收试剂盒说明书回收目的片段。 使用常规方法重组质粒，筛选出阳性质粒送北京 六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。 １．４．４基因组序列分析 同源性比对。从ＧｅｎＢａｎｋ下载参考序列的毒株（见 表２），从ＧｅｎＢａｎｋ下载ＮＳ５基因参考序列的毒株 将测得序列通过ＤＮＡＳＴＡＲ、ＢｉｏＥｄｉｔ等软件进 （见表３）。 表２从ＧｅｎＢａｎｋ下载参考序列的毒株及其缩写 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ ＹＹ５ ＮＳ５ Ｄｕｃｋ ｌｆａｖｉｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＹＹ５ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ＨＱ６４１３９ｏ．１ Ｆｅｎ￣ｘｉａｎ ＮＳ５ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ Ｆｅｎｇｘｉａｎ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ＨＱ８３３３３１．１ Ｈｕａｂｅｉ ＮＳ５ Ｄｕｃｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｏｖａｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｕａｂｅｉ Ｎｓ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ＪＦ５２３１８７．１ Ｓｉｔｉａｗａｎ ＮＳ５ Ｓｉｔｉａｗａｎ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ＡＢＯ２６９９４．１ ＴＨＣＡｒ ＮＳ５ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＴＨＣＡｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ５）ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ＡＦＯ１３４Ｉ ．１ ＮＳ５ ３１８６／９８ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｌａ ｅｄｓ ｓｔｒａｉｎ：３１８６／９８ ＡＢ１ １Ｏ４８６．１ ＮＳ５ １６６５／９６ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ｓｔｒａｉｎ：１６６５／９６ ＡＢ１ １Ｏ４８５．１ ＮＳ５ Ｓｉｔｉａｗａｎ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ｏｆｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ｓｔｒａｉｎ：Ｓｉｔｉａｗａｎ ＡＢ１ １Ｏ４８９．１ ＭＭ１７７５ ＮＳ５ Ｔｅｍｂｕｓｕ＿ｖｉｍｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＭ１７７５ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＳ５）ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ＡＦ０１３４０８．１ ＮＳ５ ４２５６１００ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ｓｔｒａｉｎ：４２５６／００ ＡＢ１ １Ｏ４８７．１ ＮＳ５ ＭＭ１７７５ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ｏｆｒ ＮＳ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ｓｔｒａｉｎ：ＭＭ１７７５ ＡＢ１ １Ｏ４８８．１ Ｎ２ ｒｅｖｉｖｅｄ １４／６／８２ ＮＳ５ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｎｏｔｅ Ｎ２ ｒｅｖｉｖｅｄ １４１６１８２ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ５（Ｎｓ５）ｇｅｎｅ ｐａｒｔｉｌａ ｃｄｓ ＥＵ３０３２３３．１ ＢＹＤ一１ Ｂａｉｙａｎｇｄｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＹＤ－１ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ ＪＦ３１２９１２．１ ｄｕｃｋ，ｓＤ／ＣＨＮ，２ＯｌＯ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｄｕｃｌ【，ＳＤ，ＣＨＮ，２０１Ｏ ｉｓｏｌａｔｅ ＳＤ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｃｄｓ Ｊｒ７３８０２２．１ ＪＳ８０４ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＳ８０４ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ＪＦ８９５９２３．２ ＩＴｎＴＴ ｒｃ ｎ… ｈ… ｈ。 ； … ｒｉｔ；…ｉｎ ｔｒｎｉｎ ＨＢＴＴ．ＮＳＳ ｎｍｔｅｉｎ ｇｅｎｅ Ｄａｒｔｉａｌ ｃｄｓ ＪＦ４２３ｌ２３．１ －７６・ 东北农业大学学报 第４４卷 表５ Ｄｌｌ，Ｃ肌ＳＤｌ，１１Ｏ１２８【ＮＳＳ）与其他ＧｅｎＢａｎｋ已公布序列核苷酸同源性比较 Ｔａｂｌｅ ５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／ｌ１０１２８（ＮＳ５）ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 序列简称 同源性（％） 序列简称 同源性（％） 序列简称 同源性（％） Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ＣＪＤ０５／ＣＨＮ，２０１０ ＮＳ５ ９７．８ ＮＳ５ ３１８６／９８ ８８．３ Ｎ２ ｒｅｖｉｖｅｄ １４，６，８２ ＮＳ５ ４４．４ ＹＹ５ＮＳ５ ９８．７ ＮＳ５ １６６５／９６ ８８．３ ＢＹＤ一１ ９８．５ Ｆｅｎｇｘｉａｎ ＮＳ５ ９９．０ ＮＳ５ Ｓｉｔｉａｗａｎ ８８．２ ｄｕｃｋ，ｓＤ，ＣＨＮ／２Ｏ１０ ９８．４ Ｈｕａｂｅｉ ＮＳ５ ４０．１ ＭＭ１７７５ ＮＳ５ ８７．７ ＪＳ８０４ ９８．５ Ｓｉｔｉａｗａｎ ＮＳ５ ８７．１ ＮＳ５ ４２５６，Ｃｌ０ ８ ８．Ｏ ＨＢＪＬ ＮＳ５ ９７．７ ＴＨＣＡｒ ＮＳ５ ９１．８ ＮＳ５ ＭＭ１７７５ ８７．８ ＪＱ２８９５５０．１ ＴＡ ＮＣ＿０１６９５８．１ Ｄｕｃｋ ｌｆａｖｉｖｉｒｕｓ ＴＡ ＪＱ５９５４０７．１ＸＨＺＤ／２０１Ｏ ＪＦ３１２９１２．１ ＢＹＤ一１ ＪＸ２７３１５３．１ Ｊｓ／２０１０ ＪＦ８９５９２３．２ ＪＳ８０４ ＮＣ．０１５８４３．２ Ｔｅｍｂｕｓｕ ＪＦ４５９９９１．１ ＺＪ一６ ＪＦ２７Ｏ４８Ｏ．１ ＹＹ５ ＪＱ３１４４６４．１ ｚＪ＿４０７ ＪＱ３１４４６５．１ ｚＪ＿ＧＨ一２ ＪＦ９２６６９９．２ ＣＪＤＯ５ ＪＸ１９６３３４．１ Ｗｈｉｔｅ Ｋａｉｙａ ｄｕｃｋ ℃ｈｉｎａ／２０１０ ＪＮ８１ １５５８．１ ＦＳ ＪＮ８１１５５９．１ ＪＭ ＪＮ２３２０７７．１ ｍｕｓｅｏｖｙ／ＳＤ／Ｃｈｉｎａ／２０１１ Ｄｌｌ，ＣＨ，ＬＳＤ／１ １０１２８ ＪＸ４７７６８５．１ ＭＭ１７７５ ＪＸ４７７６８６．１ Ｓｉｔｉａｗａｎ ＮＣ－０１２５３４．１ Ｂａｇａｚａ ＮＣ＿００９０２８．２ Ｉｌｈｅｕｓ ＤＱ２１ １６５２．１ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ＮＹ９９ ＮＣ＿００２６４０．１ Ｄｅｎｇｕｅ ４ Ｘ０３７００．１ ＹｅＵｏｗ ｆａｖｅｒ １７Ｄ ｖａｃｃｉｎｅ ０．６ ０．５ ０．４ ０．３ ０．２ ０．１ ０ 图３鸭坦布苏病毒ＤＵ／ＣＨ／ＬＳＤ／ｌ１０１２８株系统进化分析 Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＴＭＵＶ ＤＵ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８ ｓｔｒａｉｎ 表６ Ｄｕ，ＣｌＩ，ＬＳＤ，１１０１２８株与其他ＧｅｎＢａｎｋ已公布序列核苷酸同源性比较 Ｔａｂｌｅ ６ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８ ｗｉｈｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｏｆｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 序列简称 同源性（％） 序列简称 同源性（％） 序列简称 同源性（％） Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ＢＹＤ一１ ９８．５ ＺＪＧＨ一２ ９８．５ Ｔｅｍｂｕｓｕ ９８．６ ＣＪＤＯ５ ９８．２ Ｉ．Ａ ９８．５ Ｄｕｃｋ ｌｆａｖｉｖｉｍｓ ＴＡ ９８．５ ＺＪ一６ ９８．５ ＪＳ８０４ ９８．５ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ＮＹ９９ ６２．２ ＦＳ ９８．５ ＸＨＺＤ，２０１０ ９８．５ ＭＭ１７７５ ８８．４ ＪＭ ９８．４ Ｄｅｎｇｕｅ ４ ５７．４ Ｓｉｔｉａｗａｎ ８７．２ ｍｕｓｅｏｖｙ／ＳＤ／Ｃｈｉｎａ／２０１ １ ９８－４ Ｙｅｎｏｗ ｆｅｖｅｒ １７Ｄ ｖａｃｃｉｎｅ ５２．８ Ｗｈｉｔｅ Ｋａｉｙａ ｄｕｅｋ／ＷＲ／Ｃｈｉｎａ／２０１０ ９８．５ ＹＹ５ ９８．６ Ｈｈｅｕｓ ６２．８ ＪＳ／２０１０ ９８．６ ＺＪ４０７ ９８．５ Ｂａｇａｚａ ７２．１ 第３期 刘胜旺等：一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析 ＡＢ１ １Ｏ４８７．１ ＮＳ５ ４２５６，Ｃｌ０ ＡＢ１ １０４８９．１ ＮＳ５ Ｓｉｔｉａｗａｎ ＡＢＯ２６９９４．１ Ｓｉｔｉａｗａｎ ＮＳ５ ＡＢ１ １０４８５．１ ＮＳ５ １６６５／９６ ＡＢ１ １Ｏ４８６．１ ＮＳ５ ３１８６，９８ ＡＢｌｌＯ４８８．１ ＮＳ５ ＭＭ１７７５ ＡＦ０１３４０８．１ ＭＭ１７７５ ＮＳ５ ＡＦ０１３４０９．１ ＴＨＣＡｒ ＮＳ５ ＪＦ４２３１２３．１ ＨＢＪＬ ＮＳ５ Ｄｕ／ＣＨ，ＬＳＤ，１ １０１２８ ＨＱ８３３３３．１ Ｆｅｎｇｘｉａｎ ＮＳ５ ＪＦ８９５９２３．２ ＪＳ８０４ ＪＦ３１２９１２．１ ＢＹＤ一１ Ｈ０６４１３９０．１ ＹＹ５ ＮＳ５ ＪＦｖ７３８０２２．１ ｄｕｅｋ，ＳＤ／ＣＨＮ／２０１０ ＪＦ７９５４７７．１ ＣＪＤＯ５，ＣＨＮ，２０１０ ＮＳ５ ＥＵ３０３２３３．１ Ｎ２ ｒｅｖｉｅｖｅｄ １４／６／８２ ＪＦ５２３ｌ８７．１ Ｈｕａｂｅｉ ＮＳ５ １．４ ｌ＿２ １．Ｏ Ｏ．８ Ｏ．６ ０．４ ０．２ ０ 图４鸭坦布苏病毒Ｄｕ，Ｃ肌ＳＤ，ｌ１Ｏ１２８株ＮＳ５基因系统进化分析 Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＴＭＵＶ Ｄ ℃Ｈ，ＬＳＤ，１１Ｏ１２８ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ５ ｇｅｎｅ ３讨论与结论 株病毒含有一个开放阅读框，编码一个由３ ４２６个 氨基酸组成的多聚蛋白，主要包含３个结构蛋白和 鸭黄病毒病最早于１９９５年出现在河北省石家 ７个非结构蛋白，其中有一个囊膜蛋白Ｅ和一个与 庄、邯郸等地，首次鉴定该病的病原为黄病毒科 ＲＮＡ相连的核心蛋白ｃ，以及一个较大的前体蛋白 的鸭病毒性脑炎病毒，国外未见报道 ”。２０１０年初 ＰｒＭ。紧接着是非结构蛋白ＮＳ１，为一种糖蛋白， 开始，在我国大部分集中养鸭地区爆发。该病迅 以及ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ和ＮＳ５ｔ 。 速传播，患病鸭多出现脚麻痹、头颈歪斜等运动 通过对试验分离株Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１ １０１２８与ＧｅｎＢａｎｋ 机能失调等神经症状，产蛋量急剧下降，表现为 已公布的一些黄病毒科病毒的基因序列进行核苷 出血性卵巢炎症状ｎ ，临床易与禽流感新城疫混 酸同源性比较和系统进化树分析，发现试验分离 淆，建立灵敏准确的实验室诊断该病的方法非常 株Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１１０１２８与黄热病毒（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ 重要，颜丕熙等建立的套式ＲＴ—ＰＣＲ方法，灵敏 ｖｉｒｕｓ）、登革热病毒（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、伊利乌斯脑炎 度比常规ＰＣＲ高１０倍，临床样品阳性检出率高于 病毒（Ｉｌｈｅｕｓ ｖｉｒｕｓ）、西尼罗病毒（ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、 病毒分离率ｎ 。Ｙａｎ等建立了ＴａｑＭａｎ探针荧光定 巴格扎病毒（Ｂａｇａｚａ ｖｉｒｕｓ）和坦布苏病毒（Ｔｅｍｂｕｓｕ 量ＰＣＲ方法，灵敏度是常规ＰＣＲ的１００倍“６１。截 ｖｉｒｕｓ）具有遗传进化关系。其中与黄热病毒（Ｙｅｌｌｏｗ 至目前尚没有可有效防治ＤＴＭＵＶ的商品化疫苗研 ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）亲缘关系最远，与巴格扎病毒（Ｂａｇａｚａ 制成功，感染ＤＴＭＵＶ后病鸭产生的抗体效价较 ｖｉｒｕｓ）亲缘关系较近但遗传距离介于病毒种的水平 低ｐ’７－８］鸡亦可对ＤＴＭＵＶ产生特异性免疫应答反 上。与其他株坦布苏病毒亲缘关系最近，全基因 应 习。筛选出抗原性良好的天然疫苗株对进一步研 组核苷酸同源性和ＮＳ５基因核苷酸同源性均在 究开发效果确实的灭活苗和弱毒苗有至关重要作 ８７％以上，可以确定试验分离株Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／ 用。 １ １０１２８属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒恩塔 对黄病毒的分类，国际上公认分类方法是病 亚病毒群的坦布苏病毒。 毒ＮＳ５基因核苷酸同源性在８４％以上的分离株为 黄病毒可引起人类和动物严重疾病，禽源司 同一个种病毒㈣。本试验对病料进行病毒分离检测 提阿万病毒（Ｓｉｔｉａｗａｎ ｖｉｒｕｓ）只对家禽致病不变。传 和全基因组序列测定分析，确定Ｄｕ／ＣＨ／ＬＳＤ／１ １０１２８ 统坦布苏病毒被库蚊这种传播途径所隔离，但新 ・７８・ 东北农业大学学报 第４４卷 型的鸭坦布苏病毒可对各种鸭致病，其中包括北 京鸭、樱桃谷鸭、绍兴鸭ｕ０１。李泽君研究表明该病 分离初报叨．中国动物传染病学报，２０１ １，１９（１）：２２—２６． 【８】胡旭东，路浩，刘培培，等．我国发现的一种引起鸭产蛋下降综 合征的新型黄病毒［Ｊ】．中国兽医杂志，２０１１，７：４３－４７． 【９】Ｔｈｏｍａｓ Ｊ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃｈａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｆｌａｖｉｖｉｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ ｒＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，４４：６４９－６８８． 可以通过直接接触传播和空气传播ｕ。１，这与其他坦 布苏病毒存在区别。鸭坦布苏病毒对鸟类和人类 的致病性尚不清楚，其生理和生态动力学包括病 毒周期也不甚了解。还需要更深入研究以揭示鸭 坦布苏病毒本质、生理生态学及致病性等。 【参考文献】 【１】Ｙａｈ Ｐ，Ｚｈａｏ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｄｕｃｋｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｍａｉｎｌａｎｄ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１ １，４１７（１）：１－８． 【２】滕巧泱，颜丕熙，张旭，等．一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降 及死亡【Ｊ］．中国动物传染病学报，２０１０，１８（６）：１－４． 【３】Ｓｕ Ｊ Ｌ，Ｌｉ Ｓ，Ｈｕ Ｘ 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ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ［］Ｊ．Ｖｉｒｌａ Ｊ，２０１１，８（１）：４６４． 【１７］殷震，刘景华．动物病毒学【Ｍ］．２版．北京：科学出版社，１９９７．