酵母双杂交技术研究与应用进展

酵母双杂交技术研究与应用进展

李先昆1,2,聂智毅2,曾日中23

　(1.海南大学园艺园林学院,海南儋州571737;2.中国热带农业科学院橡胶研究所,农业部橡胶树生

物学重点开放实验室,省部共建国家重点实验室培育基地———海南省热带作物栽培生理学重点实验室,海南儋州571737)

摘要　酵母双杂交是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的一种分子生物学技术,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一,获得了许多有价值的重要发现。随着分子生物学的发展,在酵母双杂交的基础上又建立起了酵母单杂、反向双杂交、三杂交及核外双杂交等多项技术,并已经成功地运用于蛋白质之间、蛋白质与DNA、RNA和配体之间相互作用的研究。对酵母双杂交及其相关技术与应用研究进展进行了综述。可以预见,在人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序完成后,酵母双杂交及其衍生技术将在功能基因组学和蛋白质组学的研究中发挥越来越重要的作用。关键词　酵母双杂交;蛋白质相互作用;功能基因组学中图分类号　Q291　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)07-02867-03ResearchandApplicationAdvancesofYeastTwo2hybridTechniqueLIXian2kunetal　(CollegeofHorticultureandGardeningofHainanUniversity,Danzhou,Hannan571737)Abstract　Yeasttwo2hybrid,whichstudiestheinteractionamongproteinsinyeasteukaryoticcellsbyusinggeneticsmethod,isaveryeffectivemolecularbiologytechnology.Itiswidelyusedinthefieldssuchasproteomics,cellularsignaltransductionandfunctionalgenomics.Andithasbecomeoneofimpor2tantexperimentmeansintheresearchfieldofmolecularbiology.Andmanyvaluablediscoverieshavebeenachievedusingthissystem.Withthedevelop2mentofmolecularbiology,basedonyeasttwo2hybrid,manytechniquessuchasyeastone2hybrid,reversetwo2hybrid,three2hybrid,andextranucleartwo2hy2bridweresetuptobeappliedintheresearchontheinteractionbetweenprotein2protein,protein2DNA,protein2RNA,andprotein2ligand.Theresearchad2vancesofyeasttwo2hybridanditsrelevanttechnologiesandapplicationweresummarized.Itcouldbeforecastthatyeasttwo2hybridanditsderivedtech2niqueswouldplaymoreandmoreimportantroleintheresearchesofthefunctionalgenomicsandproteomics.Keywords　Yeasttwo2hybrid;Protein2proteininteractions;Functionalgenomics

　　随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成,基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述,尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。系统综合分析蛋白-蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息[1]。酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法[2]。它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术,可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因[3]。酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成,酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。

1　酵母双杂交技术的原理与优点

1.1　酵母双杂交技术的基本原理　酵母双杂交体系简称双

ingdomain,DNA2BD),另一个是位于C端768～881位氨基酸

残基区段的转录激活域(Activationdomain,AD)。DNA2BD能够识别GAL4效应基因(GAL42responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并与之结合,而AD则通过与转录机器(Transcriptionmachinery)中的其他成分之间的作用,启动UAS下游的基因进行转录[4]。这2个结构域通过共价或非共价连接是转录因子发挥转录功能的关键,两者单独存在的时候并不能激活下游基因的转录反应,只有两者在空间上较为接近时,才能表现完整的GAL4转录因子活性并激活UAS下游启动子,使其下游报告基因得到转录。

基于酵母转录因子GAL4的原理,Fields等建立了酵母双杂交系统,将可能存在相互作用的2种蛋白质,即已知蛋白X和待研究蛋白Y,分别作为诱饵(bait)和猎物(prey),并分别和BD/AD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS)结合,如果X和Y之间可以形成蛋白

-蛋白复合物,使GAL42个结构域AD和BD相互接近,表现

出转录因子的活性从而启动转录,使UAS下游启动子调控的报告基因LacZ得以表达。反之,如果诱饵和猎物之间不存在相互作用,BD与AD就不能结合,报告基因则不能被启动表达。通过对报告基因表达进行检测,即可实现对蛋白质之间相互作用的研究。在目前通用的酵母双杂交系统中,根据

BD来源不同可分为真核细胞中的GAL4系统和原核细胞中

杂交体系(Two2hybridsystem),又称相互作用陷阱(Interaction

trap),是1989年由Fields等在研究真核基因转录调控中提出

并初步建立的[2]。该系统是建立在人们对酵母转录因子

GAL4的认识基础之上,完整的酵母转录因子GAL4分为结构

的LexA系统,后者因其BD来源于原核生物,在真核生物内缺少同源性,因此,可以减少假阳性的发生。

1.2　酵母双杂交的优点　与传统的研究蛋白质相互作用的

上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域,一个是位于N端1～174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNAbind2

基金项目　973计划前期研究项目(2007CB116203);中国热带农业科学

院橡胶研究所基本业务费专项资金项目(2007XJSZX02,

)XJSYWFZX2008213。

作者简介　李先昆(1982-),男,湖南沅陵人,硕士研究生,研究方向:

植物分子生物学与基因工程。3通讯作者,E2mail:hnzrz@yahoo.com.cn。

收稿日期　2008211229

方法相比,酵母双杂交技术使蛋白质相互作用的研究方法发生了革命性的改变,它可以精确地测定蛋白质之间微弱的相互作用,而且是在核酸水平操作,无须纯化大量的蛋白质,不受外界影响,易于操作。归纳起来,酵母双杂交系统具有以下优点[5],①高效:酵母转化方法简单,转化效率高,能够比

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较容易地从cDNA文库或基因组文库中直接筛选出蛋白质之间相互作用的阳性克隆。②敏感:融合蛋白在酵母细胞内的高水平表达使得双杂交系统具有较高的敏感度,可检测蛋白质之间结合常数低至1mmol/L的微弱作用。③真实:酵母细胞是真核细胞,融合蛋白之间的相互作用是在真核细胞内进行的,蛋白质经过翻译后的修饰,有可能保持蛋白质的天然空间构象和折叠状态,接近其真实的生理状态,一定程度上可代表其在细胞内的真实情况。④简捷:只需要构建诱饵表达载体,可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的繁琐步骤。⑤广泛:酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化期的材料构建cDNA文库[6],能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白的研究。

2　酵母双杂交技术的应用

他的功能有关[11]。Walhout等以线虫的生殖发育过程为研究对象,利用已知的27个线虫发育相关蛋白建立了一个大规模的双杂交系统,获得了100多个相互作用的蛋白[12]。由此可见,酵母双杂交为绘制生物体的蛋白质相互作用的网状图谱提供了条件。

2.3　酵母双杂交在病毒学中的应用　通过酵母双杂交等技

术,很多病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用已被确定。Shi等通过对HepG2和人肝cDNA文库的酵母双杂交筛选到

apoAl,这是一个高密度脂蛋白成分,与NS5A相互作用,提示NS5A参与脂代谢紊乱的病理过程,初步揭示了丙型肝炎病

毒HCV感染后普遍存在的肝脏脂肪变性的机理[13]。

2.4　在细胞信号转导研究中的应用　蛋白质间或蛋白质与

其他分子间的相互作用是细胞信号转导中重要的信号传递形式。Kiston等利用双杂交系统研究了TNF2R家族的细胞表面受体,发现它们存在一个由70～80个氨基酸构成的保守域,它是引发细胞凋亡(apoptosis)的“死亡区域”,并同时发现了一个新的具有“死亡区域”的TNF2R家族的表面受体

WSL21蛋白(DR3/APO23)[14]。Dortay等利用大规模酵母双杂

酵母双杂交系统是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技术手段,已广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其他小分子间相互作用的研究,如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及其他相关分子。其应用进展主要表现在以下几个方面:

2.1　在蛋白质组研究方面的应用　酵母双杂交系统具有相交技术检测出了拟南芥细胞分裂素信号途径中的大多数蛋白质成员间的42种新的相互作用,证明该途径中蛋白质家族之间存在明显的相互作用,而同一家族的蛋白质之间却很少发生相互作用;同时发现相互作用的网络中心是磷酸转运蛋白,它与所有其他蛋白质家族的成员都发生相互作用[15]。

2.5　筛选多肽药物和寻找药物靶标　利用双杂交系统可以

对简便、快速及不需蛋白质纯化即可相接获得编码基因的特点,采用双杂交系统从cDNA文库和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用,通过此方法已鉴定出各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控和肿瘤发生的蛋白质等。目前,酵母双杂交系统在蛋白质组学研究中,主要应用在以下几个方面:①检验一对功能已知蛋白间的相互作用。在大豆中,SyringolidereceptorP34调节avrDRpg4基因,但是Syringolide结合后P34信号传递的机理还不清楚。通过酵母双杂交筛选大豆cDNA文库,获得2个具有97%同源性的蛋白P4221和P4222,并证明P4222是

P34Syringolide受体的第2信使的一个主要成员[7]。②确定一

确定治疗所用的多肽类药物与来源于肿瘤、细菌以及病毒的蛋白质间的相互作用。此技术已逐渐被应用于筛选新型的具有生物活性的肽类药物、诊断试剂和其他功能性多肽。能抑制SrcSH2结构域并能和配体相互作用的小分子已经开发并用来治疗骨质疏松症,特别是抑制破骨细胞再吸收[16]。胡承香等通过将随机DNA片段与GAL4的AD融合构建酵母表达载体,成功构建了一个可筛选扩增的酵母双杂交随机肽库,用于筛选和设计靶蛋白相互作用的药物多肽[17]。

3　酵母双杂交系统的局限性

对蛋白间发生相互作用的关键结构域或活性位点。AKT3是参与ABA信号转导的植物蛋白磷酸酶AtPP2CA的一个搭档蛋白,若去掉AtPP2CA催化结构域的最后180个氨基酸,

AtPP2CA便不能与AKT3发生蛋白相互作用,从而证明这一

酵母双杂交系统在研究蛋白-蛋白互相作用方面虽然有广泛的应用,但也存在一些缺陷,主要表现在以下几个方面[18]:①非普遍适用性。即并非所有蛋白质都适用于双杂交系统。该系统所研究的蛋白质必须定位于核内,才能激活报告基因的表达,因此,不能被转运到细胞核内的蛋白质,如细胞浆蛋白和细胞膜蛋白等不适用这种方法。②假阳性。这是酵母双杂交不能忽视的重要弊端之一。所谓假阳性,即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生。据统计,到2002年已筛选出约8万种蛋白质相互作用,其中只有2400种相互作用得到了多于一种方法的确认[19]。因此,在酵母双杂交系统的应用中必须考虑产生假阳性的因素。一般将筛库中所遇到的假阳性分为3种类型:Ⅰ型,AD2Y单独表达的融合蛋白即可激活转录;Ⅱ型,AD2Y表达的融合蛋白和空BD载体即可激活转录;Ⅲ型,AD2Y表达的融合蛋白与任意的BD载体表达的融合蛋白即可激活转录。双筛选系统和假阳性显示分析法等都可以基本消除假阳性。③假阴性。某些表达的融合蛋白通常在酵母菌株中

区域含有AKT3结合位点[8]。③用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库,获得与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。用截短的HsfA1做诱饵,从番茄cDNA文库筛选出了Hsf家族的一个新成员HsfA3。HsfA3是一个组成型表达蛋白[9]。Schoonheim等同时利用酵母双杂交筛选文库法、亲和纯化串联质谱等方法从大麦幼苗中筛选出150多个与142

323同工型发生相互作用的靶蛋白,其中酵母双杂交法鉴定

出132种相互作用,而亲和纯化串联质谱法只鉴定出30种相互作用,两者之间有30%的数据是重叠的

[10]

。

2.2　绘制蛋白质相互作用图谱　Fromont2Racine等以10种

功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”,从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行多轮筛选,获得约700个阳性克隆,在这些筛选到的靶蛋白中,有

9种是已知的mRNA前体剪接因子,5种是新发现的剪接因

子,8种是与RNA其他加工过程有关的因子,还有45种与其

37卷7期　　　　　　　　　　　　　　　　李先昆等　酵母双杂交技术研究与应用进展2869

产生毒性,从而抑制报告基因的表达和酵母的生长,或者蛋白间的相互作用较弱,报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来,使得酵母双杂呈现“假阴性”的结果。此外,还应意识到在不同的细胞类型、细胞空间和生长发育的不同阶段有些蛋白质是不可能发生相互作用的,蛋白质间的相互作用很可能比我们所认识的要复杂得多。

4　酵母双杂交技术的改进与发展

乳动物双杂交系统可克服酵母双杂交系统的不足,适用于对蛋白质功能的进一步研究,其原理和酵母双杂交系统相同,把编码诱饵蛋白和靶蛋白的基因克隆到相应的载体上,采用磷酸钙共沉淀转入Hela等哺乳动物细胞中,当饵蛋白和靶蛋白发生相互作用时,激活了报告基因,可通过报告基因的表达产物进行检测。哺乳动物双杂交系统已成功地验证了小鼠P53蛋白与SV40大T抗原之间以及FRAP与FKBP12两种蛋白之间的相互作用。

5　展望

由于酵母双杂交系统仍存在着一定的缺陷与局限,基于酵母双杂交的基本原理,近年来,双杂交系统在被广泛应用中不断得到改进,产生了许多相关的研究方法与技术,其灵敏度和特异性也得到了显著提高。

4.1　酵母单杂交系统　酵母单杂交系统(One2hybridsystem)

酵母双杂交技术问世近20年来,已经在研究蛋白质之间的相互作用,筛选新的多肽药物,研究基因和蛋白质的功能等方面发挥了重要作用。酵母双杂交及其衍生系统在生物学各个领域应用的不断深入,为我们展示了一个获得生物体内蛋白质之间纷繁复杂作用关系的有效途径。随着酵母双杂交系统的不断完善与改进,酵母双杂交及其相关技术将得到更广泛的应用,在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中将发挥越来越重要的作用。酵母双杂交系统在巴西橡胶树功能基因组学及蛋白质组学研究中的应用,将进一步揭示橡胶树产胶及其化学调控的分子机制。巴西橡胶树原产于南美洲亚马逊河流域的热带丛林,是天然橡胶的唯一来源。1904年首次引种到我国,现大面积种植于华南热带与亚热带地区,对我国的国民经济和国防建设有着重要的战略意义[25]。由于橡胶树是多年生乔木,研究难度较大,相对于模式植物和粮食等经济作物,橡胶树分子生物学的研究起步晚,研究明显滞后。目前,有关橡胶树基因组学和蛋白质组学的研究成果并不多,橡胶生物合成及其调控的分子机制并不十分明了,橡胶树死皮病的发生机理仍有待深入研究。利用酵母双杂交系统及其相关衍生技术,我们可以设计出更多更巧妙的相互作用陷阱来获取橡胶树中新的未知功能基因和未知蛋白,为进一步研究橡胶生物合成的分子途径,乙烯和茉莉酸调控橡胶合成的信号转导和橡胶树死皮病发生的分子机制及其防治技术提供更多有价值的理论依据。参考文献

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最早是1993年由Li根据酵母双杂交技术的原理提出的,用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用[20]。单杂交系统与双杂交系统的区别在于前者把要研究的DNA序列置于报告基因上游,以这段特异性的DNA序列为诱饵,去筛选cDNA文库编码的靶蛋白,不需要BD2X的参与;而双杂交系统是用诱饵蛋白来筛选与之结合的蛋白。单杂交系统在细胞信号转导以及基因调控等功能研究中有重要作用。4.2　反向双杂交系统　反向双杂交系统(Reversetwo2hybridsystem)最早是在1996年由Vidal等提出的[21]。该系统采取

反向筛选的方法,最大的特点就是将蛋白质之间的解离作用变为一种选择优势,其关键在于逆向报告基因的引入。常用的报告基因有3种,即URA3、CYH2和LYS2。当野生型BD2X与AD2Y间发生相互作用时,启动了毒性报告基因的表达,它对酵母菌株有毒性或者是致死的。当二者解离时毒性报告基因不能表达,菌株具有生长优势。在对蛋白质中有重要作用的功能域、作用位点以及影响蛋白质结合或解离因素的研究中,反向双杂交系统发挥了重要作用。

4.3　核外双杂交系统　核外双杂交系统是构建在一个非转

录基础上的双杂交系统,也叫SOS蛋白招募系统(SOSrecruit2

mentsystem)

[22]

。它是把蛋白质相互作用的场所从核内转移

到酵母的细胞膜上,通过应用2个蛋白质相互作用后对Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制,克服了传统双杂交系统的一些局限性。SOS蛋白招募系统的主要优点在于被研究蛋白质的相互作用是发生在细胞质而不是细胞核中,因此,其应用范围更加广泛,但同时也存在一些假阳性问题。

4.4　三杂交系统　三杂交系统(Three2hybridsystem)是Sen2Gupta等于1996年发展起来的,其基本原理与双杂交系统基

本相同,只是2个蛋白的相互作用需通过第3个分子的介导[23]。这一系统的主要特征是2个融合蛋白在空间上的靠近需要第3个分子的参与,第3分子可以是蛋白质、激酶、多肽、DNA、RNA或小分子配体等。它们可通过修饰诱饵蛋白或靶蛋白使二者发生相互作用,或者诱导它们的构象发生改变从而产生相互作用,进而启动报告基因的表达。

4.5　哺乳动物双杂交系统　哺乳动物双杂交系统能够检测

相互作用依赖于需经蛋白质翻译后修饰的蛋白质[24]。酵母菌属于低等的真核生物,对蛋白质翻译后的加工修饰如糖基化、甲基化、磷酸化以及二硫键的形成等修饰水平很低。哺

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怕领导干部不切合实际。

4.2　追求时髦　近年来我国不少城市在景观设计上追求

锻炼,使人们身心健康。健康景观首先在美国提出,而在国内还是一个全新的概念。美国是一个汽车社会,物质丰富,但许多人缺少锻炼,因此,景观设计建设中“如何给人提供更多锻炼的机会,以步代车”是设计师们所要考虑的问题。比如,把机动车道变窄,人行道加宽,增加人行道绿化,不仅有利于节能,还有利于身心健康。

5.3　艺术景观　艺术在现代景观设计中,不应该成为最后

“草坪热”,结果从国外引进草种所培育的草坪,不耐践踏只能观赏,不仅失去了在草坪上进行活动的功能,同时还消耗大量的浇灌用水。显而易见,这种追求时髦的做法是不恰当的,尤其在干旱少雨、水资源原本就很紧缺的北方地区,就更值得商榷了。据北京大学景观规划设计中心对国外高新技术园区所做的调查表明,与草坪相比,人们更偏爱树木。因为树木具有多功能性,不仅可以美化环境,还具有造氧、遮阳、除尘、降噪以及吸收废气、保持水土、增加湿度等功效。

4.3　规划、建筑、景观三者脱节　世界上也许没有完美的设

的摆设和点缀,艺术对景观设计而言,也不只是一种形式语言借鉴的来源,而是一种思维方式。虽然沿袭传统园林设计中以艺术审美为指导的方法论,已不完全适合现代景观设计学发展的需求,但这并不意味着要把艺术打入“冷宫”。在当今遭遇民族身份危机和全国“千城一面”的情况下,艺术作为一种思想工具,在景观设计的创新中应该发挥它应有的魅力。艺术景观就是将景观设计得更美,更有文化内涵,经得起历史的考验。6　结语计,但规划、建筑、景观一体化的设计肯定更接近于完美。目前,国内的城市虽然也进行了总体规划,但许多项目都仅由规划师、建筑师完成,景观设计师很少能从起始阶段参与其中,造成景观建设的被动性,同时总体规划并不能解决那些需要由景观设计来解决的问题,景观建设基本上还处于无序状态。因此,现代城市景观设计要求规划、建筑、景观三位一体,将长远目标与近期建设相结合,策划高于规划,力求国际合作,各行业共同参与,以科技为支撑,融合与创新并举,走有中国特色的城市建设之路。5　现代城市景观设计发展趋势5.1　生态景观　生态景观的核心要义是如何围绕“城市让

现代城市景观目前在我国越来越受到人们重视是历史发展的必然。但我们应看到建设良好城市景观的长期性和艰巨性,要从城市自身特色出发,继承本土文化并借鉴国外经验,注重经济、实用,强调精心设计,走“建筑、规划和景观三位一体“的道路,力求设计出富有中国特色的现代城市景观。参考文献

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5.2　健康景观　健康景观是从人类自身健康的角度,对公

众活动场所,如广场、街道、小区等进行建设,鼓励人们运动、

(上接第2869页)

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