鱼壁墨 堂盘查 Ｑ 垒生箜 鲞箜 塑 』 垦 ＡＮＡＴ ＯＰＥＲ ＳＵＲＧ，‘２０１４。Ｖｏ１２３．Ｎ。．２ ．小鼠微小ＲＮＡ ｍｉＲ－２１真核表达载体构建及其在２９３细胞的活性表达 龙 爽，粟永萍，任 洞，孙慧勤，王 涛 （第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验 ，室，重庆市纳米医药工程技术研究中心，重庆４０００３８） 要］ 目的构建小鼠微小ＲＮＡ ｍｉＲ－２１的真核表达载体，在人胚肾２９３细胞中验证其活性表达为进一步以此载体研究 ｍｉＲ・２１的功能打下基础。方法根据小鼠ｍｉＲ一２１的成熟序列及其上下游约１７０ ｂｐ的序列设计引物利用ＰＣＲ技术从小鼠基因组 ，，［摘ＤＮＡ扩增含有ｍｉＲ一２１前体的片段３８２ ｂｐ，克隆到质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ，对重组质粒经双酶切及测序分析，鉴定完全正确后转染人胚肾 ２９３细胞，Ｇ４１８（１ ０００ ｍｇ／Ｌ）筛选后获得ｍｉＲ－２１稳定表达细胞系，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ验证其在２９３细胞的过表达；同时构建ｐｍｉＲ－２１．Ｌｕ。 ｒｅｐｏｔｒｅｒ荧光素酶报告质粒，与ｍｉＲ一２１重组质粒共转染２９３细胞进行荧光素酶活性分析，验证其调控活性。结果成功构建小鼠 ｍｉＲ－２１的真核表达载体，其可以在２９３细胞中稳定高效表达，荧光素酶活性实验证实其有生物活性。结论成功构建小鼠ｍｉＲ ２１ 的真核表达载体，为进一步探讨ｍｉＲ－２１的生物学功能奠定了实验基础。 ［关键词］ｍｉＲＮＡｓ；ｍｉＲ．２１；真核表达载体；２９３细胞 ［中图分类号］Ｒ３９４－３３；Ｒ３９４．３；Ｑ７８２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１６７２－５０４２（２０１４）０２－０１１１－０４ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－２１ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ２９３ ｃｅｌｌｓ ＬＯＮＧ Ｓｈｕａｎｇ，ＳＵ Ｙｏｎｇ—ｐｉｎｇ，ＲＥＮ Ｊｉｏｎｇ，ＳＵＮ Ｈｕｉ—ｑｉｎ，ＷＡＮＧ Ｔａｏ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｎｊｕｒｙ，Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒａｕｍａ，Ｂｕｒｎｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｎｊｕｒｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｍｉｌｉ－ ｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－２１ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖ— ｉｔｙ ｉｎ ２９３ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｅ—ｍｉＲ－２１ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＲＣ／ＣＭＶ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲＣ／ＣＭ￣一ｍｍｕ—ｍｉＲ－２１ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｔｏ ２９３ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２００ｏ． ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｇ４１８，ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲ－２１ ｂｙ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｎｔｉｍｅ，ａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘａｍｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉＲ－２１ ｎａｍｅｄ ｐｍｉＲ一２１一Ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｗａｓ ａｌｓｏ ｃｏｎｓｔｕｒｃ－ ｔｅｄ，ａｎｄ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｍｕ・ｍｉＲ－２１ ｉｎｄｅｅｄ ｈａｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂｏｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔ¨ 著 ● ｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉ● ｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．Ｔｈｅ ｍｉＲ－２１ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ２９３ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｉＲ－２１ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉＲ－２１ ｄｕｒｉｎｇ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉＲＮＡｓ；ｍｉＲ一２１；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；２９３ ｃｅｌｌｓ 微小ＲＮＡｓ（ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）是一类由基因 是一类重要的调控分子，其在创伤修复中的作用也越 组编码的长度约２０ ｎｔ的高度保守的内源性微小的非 来越受到重视 引。我们和其他学者均发现，ｍｉＲ－２１ 编码单链ＲＮＡ分子，通过与对应的靶ｍＲＮＡ的３’非 在皮肤创伤愈合过程中表达上调，创面局部抑制其表 翻译区（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ，３’ＵＴＲ）的非完全或完 达能够显著削弱愈合的速度与质量，证实其是创伤促 全配对结合，从而阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对 愈的重要分子，也提示其可能是促进创伤愈合的新的 基因表达的调控 。越来越多的研究表明，ｍｉＲＮＡｓ 治疗靶点ｌ４ 。为进一步研究ｍｉＲ－２１作为潜在治疗靶 参与了细胞增殖、凋亡、分化等众多基础生物学事件， 点的可行性，本研究构建了ｍｉＲ－２１真核表达质粒，为 后续使用其进行创面局部干预治疗奠定了基础。 ｄｏｉ：１０．１ １６５９／ｊｊｓｓｘ．１６７２－５０４２．２０１４０２００１ ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９０１５５８）；烧伤、创伤与 １材料与方法 复合伤国家重点实验室自主课题（ＳＫＬＺＺ２０１１２２） ［通讯作者］王涛，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｔｍｍｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ １．１材料 ［收稿日期］２０１４－０１一ｌ１ ［修回日期］２０１４－０２—１２ 质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＭＩＲ—Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｂ一半乳糖苷酶质粒、大肠杆 ・１ １２・ 局解手术学杂志 ２０１４年第２３卷 第：期 』壁 ！ 垦兰 旦 ： 竺： 菌ＤＨ５ａ和２９３细胞由本所保存。快速质粒提取试剂盒、胶回 收试剂盒、８半乳糖苷酶检测试剂盒和荧光素酶活性检测试剂 盒购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司，基因组ＤＮＡ提取试剂盒和ＰＣＲ产物纯 化试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品。限制性内切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合 酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、总ＲＮＡ提取试剂ＲＮＡｉｓｏ购自ＴａＫａＲａ公 司，引物和探针由上海英骏公司合成，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０ｏ０购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。尼龙膜为Ｒｏｃｈｅ公司产品，杂交液购自Ｃｌｏｎ— ｔｅｃｈ。 １．２ 方法 １．２．１ ＰＣＲ引物的设计与合成 根据Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ数据 库所提供的含有ｍｉＲ－２１前体序列（ｐｒｅ—ｍｉＲ－２１）的小鼠基因组 序列，针对ｐｒｅ—ｍｉＲ一２１上游１５４ ｂｐ和下游１３６ ｂｐ之间的３８２ ｂｐ 的区域设计引物，并在引物上引入末端的保护性碱基、Ｈｉｎｄ ｌｌＩ 和Ｘｂａ Ｉ的酶切位点（下划线序列）。引物由上海英骏生物技 术有限公司合成。引物序列如下：Ｆ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴ— ＴＣＡ唧Ｇ唧ＧＣ－３’：Ｒ：５’一ＴＧＣＴＣＴＡＧＡ ＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴ— ＧＣＴＧＴｒＧＴ－３’。 １．２．２ ＰＣＲ扩增 取Ｃ５７小鼠１只，剪取尾部组织，依照试 剂盒说明提取全基因组ＤＮＡ。以小鼠基因组ＤＮＡ为模板，行 ＰＣＲ扩增，得到约３９０ ｂｐ的目的片段，退火温度为５０℃。 １．２．３真核表达载体ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｍｕ—ｍｉＲ一２１构建与鉴定 以ＨｉｎｄⅢ和Ｘｂａ Ｉ对质粒ｐＲＣ／ＣＭＶ行双酶切，酶切后对产物 进行胶回收。同时对ＰＣＲ扩增的ｍｍｕ—ｍｉＲ－２１基因的产物以 ＰＣＲ产物纯化试剂盒进行纯化后也以Ｈｉｎｄ ｌｌＩ和Ｘｂａ Ｉ双酶 切，酶切后重复进行产物纯化。将酶切纯化后的ｐＲＣ／ＣＭＶ和 ｍｍｕ—ｍｉＲ一２１ＰＣＲ片段以Ｔ４ＤＮＡ连接酶１６ ｑｃ连接过夜，电转法 转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｃ￣感受态细菌，ＬＢ平板筛选氨苄青霉素抗性克 隆，菌落ＰＣＲ初步鉴定阳性克隆，Ｈｉｎｄ ｌｌＩ／Ｘｂａ Ｉ双酶切鉴定后 送测序进一步证实。 １．２．４ ｐｍｉＲ一２１一Ｌｕｃ ｒｅｐｏ￣ｅｒ荧光素酶报告质粒的构建 合 成含有与ｍｉＲ一２１分子完全互补的寡核苷酸序列．Ｆ：５’ ＣＡＡＴ— ＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡｇｃｔｃａｇｃＡＡＴＧＣＡ一３’； Ｒ：５’一ＡＧＣＴＴＧＣＡ ＩＴｇｃｔｇａｇｃＴＡＧＣ ＴＴＡＴＣＡ ＧＡＣＴＧＡＴＧＴＦＧＡＡＣ— ＴＡＧＴＧＣＡＴｒＧＡＧＣＴ一３’。正向序列下划线为其与成熟的ｍｉＲ一 ２０６分子完全互补的ＤＮＡ序列；小写字母序列为引入的Ｂｌｐ Ｉ 酶切位点序列，以便于连接成功后的鉴定；反向序列与正向除 完全互补外，在两端引入了Ｓａｃ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ突出的酶切位点序 列，以斜体大写字母表示。以Ｓａｃ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ对ｐＭＩＲ—Ｒｅｐｏｒｔｅｒ 质粒进行双酶切而后纯化回收与寡核苷酸退火产物以Ｔ４ＤＮＡ 连接酶１６℃连接过夜，电转法转入Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ感受态细菌， ＬＢ平板筛选氨苄青霉素抗性克隆，Ｈｉｎｄ ｍ／Ｘｂａ Ｉ双酶切鉴定 后送测序进一步证实。 １．２．５细胞转染与稳定克隆的筛选 人胚肾２９３细胞，在 含１０％新生牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基中于３７℃、５％ＣＯ，的 孵箱中培养。转染前２４ ｈ以胰酶消化２９３细胞，计数后以每孔 １×１０ 的数目接种于２４孔板内。转染按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２ ０００ 的说明书进行，分别转染ｐＲＣ／ＣＭＶ空载体和ｐＲＣ／ＣＭＶ ｉｎｍｕ— ｍｉＲ－２１等２个组别。转染后６ ｈ，更换其完全培养基。转染后 ２４ ｈ，换以含Ｇ４１８（１ ０００ ｕｇ／ｍＬ）的筛选培养基进行筛选，３周 后获得稳定细胞系，扩大培养。 １．２．６稳定转染２９３细胞ｍｉＲ一２１的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 转 染后获得的稳定细胞系用ＲＮＡｉｓｏ裂解，提取总ＲＮＡ具体方法 参照说明书进行。ＤＮＡ探针序列ｍｉＲ一２１：５＇＿ＴＣＡＡＣＡＴ— ＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ．３’，采用地高辛在３’末端标记探针。取 ２０ ｇ总ＲＮＡ上样，行２０％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 分离，半干转印恒流０．４ Ａ转尼龙膜１ ｈ。紫外交联 １ ２００ ｐ．Ｊ／ｍｉｎ．而后８０℃烘烤１ ｈ，加入探针后于４２℃杂交过 夜。洗膜后以含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ封闭１ ｈ，碱性磷酸酶 （ＡＰ）标记的地高辛抗体１：ｌ ０００在３７℃孵育２ ｈ，ＮＢＴ／ＢＣＩＰ 系统进行显色。 １．２．７重组ｍｉＲ－２１真核表达质粒的荧光素酶活性检测 收集培养的２９３细胞，转染前１ ｄ铺２４孔板，培养２４ ｈ后将对 照空质粒与重组ｍｉＲ－２１表达质粒（每孔２００ ｎｇ）分别与ｐｍｉＲ一 ２１ Ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ和Ｂ一半乳糖苷酶质粒（每孑Ｌ １００ ｎｇ）进行共转 染，设３个复空。转染后２４ ｈ弃去细胞培养液，ＰＢＳ洗２次，每 空加入细胞裂解液１５０ ｌ，充分裂解细胞后，按照说明书分别 进行样品的荧光素酶活性和Ｂ一半乳糖苷酶活性测定。计算荧 光素酶／Ｂ一半乳糖苷酶活性活性比值（Ｌｕｃ／￣一ｇａ１），以均数±标 准差（ ４－Ｓ）表示，以空质粒对照组活性为１００％，计算重组 ｍｉＲ－２１真核表达质粒的相对荧光素酶活性。 １．２．８统计学处理 数据以均数±标准差（ｉ±ｓ）表示，进 行单因素方差分析，检验水准以Ｐ＜０．０５认为有统计学意义。 ２结果 ２．１ ＰＣＲ扩增含有ｐｒｅ—ｍｉＲ一２１的基因组片段 以小鼠基因组ＤＮＡ为模板进行ｍｉＲ一２１前体对应的基因 组片段扩增，ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳，在３９０ ｂｐ处 有一清晰特异扩增条带，片段大小与预测长度相符（图１）。 ２．２ 重组质粒ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｍｕ ｍｉＲ．２ｌ构建 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ Ｉ双酶切ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｍｔｌ—ｎｆｉＲ．２１重组载体， １％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为０．４ ｋｂ和５．５ ｋ｝１片段。其 中０．４ ｋｂ片段为含有ｍｉＲ一２１的前体片段，５．５ ｋｈ片段为ｐＲＣ／ ＣＭＶ载体，经测序证实插人片段与预测结果完全相符（图２）。 ２．３重组ｐｍｉＲ一２１一Ｌｕｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ荧光素酶报告质粒构建 回收Ｓａｃ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ双酶ｐＭＩＲ—Ｒｅｐｏｒｔｅｒ质粒的产物与前述 寡核苷酸的退火产物进行连接后电转感受态菌，涂氨苄青霉素 抗性ＬＢ平板后培养挑取克隆摇菌。对所得的克隆行Ｂｌｐ Ｉ单 酶切可见阳性克隆能够被成功线性化，出现大小约６ ５００ ｂｐ的 条带（图３）。进一步测序证实插人片段与预期设计完全相符。 ２．４ 稳定转染ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｌＴＩＨ—ｍｉＲ一２１的２９３细胞 ｍｉＲ一２１表达的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定 对稳定转染ｐＲＣ／ＣＭＶ空载体和ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｒｔｌｍＨ ｍｉＲ一２１ 重组质粒的２９３细胞提取总ＲＮＡ，行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检￣ｍｉＲ－２１ 结果显示：转染ｐＲＣ／ＣＭＶ空载体的２９３细胞没有杂交信号，而 转染ｐＲＣ／ＣＭＶ—ｍｌｎｕ—ｍｉＲ－２１重组质粒的２９３细胞中可见明显 而特异的杂交条带（图４）。 局解手术学杂志 ２０１４年第２３卷第２期 Ｊ ＲＥＧ ＡＮＡＴ ＯＰＥＲ ＳＵＲＧ，２０１４，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．２ 学者认为，ｍｉＲ．２１在静脉曲张难愈性创面表达上调， 参与了创面难愈的发生＿】 。这种截然相反的结论是 实验动物种属的差别所致，还是实验材料的不同所致， 很有理清的必要。我们认为其在损伤后的广谱表达上 调，抑制后的修复延迟，都提示ｍｉＲ．２１具有作为促愈 靶点的潜力。而创面直接注射裸质粒是一种有效的实 验性促愈效应观察手段，为此我们构建了ｍｉＲ－２１的真 核表达载体。 作为内源性分子的ｍｉＲＮＡｓ通常是通过ｐｏｌ－１Ｉ启 动子启动转录，进而经过复杂的剪切加工才形成成熟 的单链功能分子¨ 。但利用人工的ｓｈＲＮＡ的质粒 骨架，引入类似于ｓｉＲＮＡ的较短设计序列也可以实现 ｍｉＲＮＡ产物的高效加工表达 。然而，作为内源性 调控分子的ｍｉＲＮＡｓ的加工有其特殊性，这一点在 ｍｉＲ－２１分子的表现很明显，ｍｉＲ－２１分子的表达除了受 到转录调控外，还存在ＴＧＦ－／Ｓｍａｄ通路的转录后调 控 。考虑到后续创面研究的实际情况，存在创面大 量ＴＧＦ一￥分子的表达¨ 。因此本研究选择了带有 ＣＭＶ启动子的ｐＲｃ／ＣＭＶ质粒。我们将含有ｐｒｅ．ｍｉＲ一 ２１片段的大约４００ ｂｐ的ＰＣＲ产物克隆到该真核表达 载体，经酶切鉴定和测序验证，成功构建了重组质粒。 然而，其能否成功表达成熟的ｍｉＲ．２１产物还需要验 证，因为转录出的序列的正确加工有赖于其与周围序 列相互作用的结构，克隆产物未必一定能加工出成熟 ｍｉＲ－２１的分子。为此我们进行了后续的鉴定工作，将 重组真核表达质粒转染到２９３细胞，经培养基中Ｇ４１８ 的筛选压力获得持续稳定表达的细胞，进而通过 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测到其确实高效表达了成熟的ｍｉＲ－２１ 分子。ｍｉＲＮＡ的作用方式主要是与靶ｍＲＮＡ分子的 ３’非翻译区（３’ＵＴＲ）结合，从而导致靶ｍＲＮＡ的降解 或抑制它的翻译。我们进一步通过荧光素酶报告基因 活性分析，确认该质粒表达的ｍｉＲ￣ｌ可以抑制报告基 因的活性，表明其具有功能。这些工作为后续在皮肤 创面研究ｍｉＲ一２１的功能和以其为靶点的促愈策略初 步奠定了基础。 ［参考文献］ ［１］Ａｍｂｒｏｓ Ｖ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｆｌｉｅｓ ａｎｄ ｗｏｒｕｌｓ：ｇｒｏｗｔｈ，ｄｅａｔｈ，ｆａｔ， ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ ｔｉｍｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００３，１１３（６）：６７３—６７６． ［２］Ｒｏｙ Ｓ，Ｓｅｎ ＣＫ．ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１２，１９（３）：２２４—２３２． ［３］Ｂｏｓｔｊａｎｃｉｃ Ｅ，Ｇｌａｖａｃ Ｄ．Ｉｍｐｏｒｔｎａｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｓｋｉｎ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ Ａｌｐ Ｐａｎｏｎｉｃａ Ａｄｒｉａｔ，２００８．１７ ｆ３）：９５—１０２． ［４］Ｙａｎｇ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｇｕｏ ＳＬ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ－２１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅ－ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａｉｚａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ［Ｊ］．１ｎｔ ＪＢｉｏｌ Ｓｃｉ，２０１１，７ （５）：６８５—６９０． ［５］Ｗａｎｇ Ｔ，Ｆｅｎｇ Ｙ，Ｓｕｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ－２１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， ２０１２，１８１（６）：１９１１—１９２０． ［６］Ｎａｉｒ ＶＳ，Ｍａｅｄａ ＬＳ，Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ ＪＰ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉ— ｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ， ２０１２，１０４（７）：５２８—５４０． ［７］Ｍｏｏｒｅ ＬＭ，Ｚｈａｎｇ Ｗ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｉＲ－２１ ｉｎ ｇＨｏｍａ：ａ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｂｉｇ ｐｏｔｅｎｔｉｌａ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ ＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓ，２０１０，１４（１１）：１２４７—１２５７． ［８］Ｘｉｏｎｇ Ｂ，Ｃｈｅｎｇ Ｙ，Ｍａ Ｌ，ｅｔ ａ１．ＭｉＲ－２１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｉｏｌｏｇＪ ｃａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＰＴＥＮ／ＰＩ－３ Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔｌａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，２０１３，４２（１）：２１９—２２８． ［９］Ｑｊ Ｌ，Ｂａｒｔ Ｊ，Ｔａｎ ＬＰ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－２１ ａｎｄ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔｓ （ＰＴＥＮ，ＰＤＣＩＭ，ＴＭ１）ｉｎ ｆｉａｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｔｙｐｉａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｕｃｔｌａ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆ Ｊ］．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ， ２００９，９：１６３． ［１０］Ｗａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｓｈｉ ｃ，ｅｔ ａ１．ＴＧＦ－ｂｅｔａ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｉＲ－２１ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ ｈａｓ ＤＯ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＥＭＴ ｏｆ ＴＧＦ；ｂｅｔａ ｉｎ ＨａＣａＴ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１２，４４（２）： ３６６—３７６． ［１１］Ｄａｓ Ａ，Ｇａｎｅｓｈ Ｋ，Ｋｈａｎｎａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｕｎｄ ｉｎｆｌａｍ— ｍａｒｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１９２（３）：１１２０—１１２９． ［１２］Ｍａｄｈｙａｓｔｈａ Ｒ，Ｍａｄｈｙａｓｔｈａ Ｈ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＭｉｅｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：ｐｒｏｍｏｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉＲ－２１ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｉ— ｒｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｗｏｕｎｄ Ｊ，２０１２，９（４）：３５５—３６１． ［１３］Ｐａｓｔｏｒ Ｉ，Ｋｈａｎ ＡＡ，Ｓｔｏｊａｄｉｎｏｖｉｃ ０，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲ— ＮＡｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｕｔｎａｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７ （３５）：２９３２４—２９３３５． ［１４］Ｃｕｌｌｅｎ ＢＲ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｅｃｕｒ－ ｓｏｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００４，１６（６）：８６１—８６５． ［１５］Ｚｅｎｇ Ｙ，Ｃｕｌｌｅｎ ＢＲ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＲＮＡ，２００３，９（１）：１１２—１２３． ［１６］Ｗｕ Ｊ，Ｂｏｎｓｒａ ＡＮ，Ｄｕ Ｇ．ｐＳＭ１５５ ａｎｄ ｐＳＭ３０ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡ ａｎｄ ｓｈＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９，４８７（２）：２０５—２１９． ［１７］Ｄａｖｉｓ ＢＮ，Ｈｉｌｙａｒｄ ＡＣ，Ｌａｇｎａ Ｇ．ｅｔ ａ１．ＳＭＡＤ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＲＯ— ＳＨＡ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５４（７２００）： ５６—６１． ［１８］Ｗｅｒｎｅｒ Ｓ，Ｇｒｏｓｅ Ｒ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｌａ Ｒｅｖ，２００３，８３（３）：８３５—８７０． ［１９］Ｃｒｏｓｓ ＫＪ，Ｍｕｓｔｏｅ ＴＡ．Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｓｕｒｇ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，２００３，８３（３）：５３１—５４５． ［２０］Ｇｒａｚｕｌ—Ｂｉｌｓｋａ ＡＴ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＭＬ，Ｂｉｌｓｋｉ ＪＪ，ｅｔ ａ１．Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ），２００３，３９（１０）：７８７—８００． （编辑：周小林）