一株海洋细菌所产琼胶酶酶学特性的研究

一株海洋细菌所产琼胶酶酶学特性的研究

蔡俊鹏，许少丹

（华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

摘要：从海水中分离筛选到一株高活力的海洋琼胶降解菌2.2-g。通过硫酸铵盐析、透析袋透析、离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到了电泳纯的琼胶酶样品，通过SDS-PAGE电泳，其分子量约为55 kDa。该琼胶酶的最适pH值和温度分别为7.0和 55 ℃。Mg2+ 和Ca2+对酶促反应有较强的促进作用，而Mn2+、Zn2+、NH4+、EDTA和SDS等则有不同程度的抑制作用。酶解产物的质谱和核磁共振谱结果证明，该琼胶酶降解琼胶后得到由新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖组成的混合物，证明该琼胶酶为β-琼胶酶。

关键词：海洋细菌；β-琼胶酶；酶学性质；酶解产物

中图分类号：Q814.1；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)12-1217-05

Characterization of Extracellular Agarase from an Agarolytic Bacterium

CAI Jun-peng, XU Shao-dan

(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Abstract: An agar-decomposing strain 2.2-g was isolated and selected from sea water. The enzyme was achieved by ammonium, dialysis and DEAE-cellulose separation, and its molecular mass was determined as 55 kDa. The most suitable pH and temperature of the enzyme were 7.0 and 55°C, respectively. Mg2+ and Ca2+ can be used as enzyme activators for this extracellular agarase, while Mn2+, Zn2+, NH4+, EDTA and SDS partially or completely inhibited its activity. MS and NMR analysis showed that the enzyme is a β-agarase, which was further validated by the components of its degraded products ( neoagarobiose, neoagarotetose and neoagarohexaose).

Key words: marine bacteria; β-agarase; Enzymeology properties; Enzymatic products;

琼胶通常又被称为琼脂、冻粉或洋菜，广泛应用于食品、生化、临床、医药等领域。琼胶是一种从江篱、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成。琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。硫琼胶结构较复杂，含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸[1]。琼胶酶降解产生琼胶低聚糖，具有高效性和专一性的特点，而且降解条件温和，水解产物不易被破坏，利于产物分析和回收，因而逐渐代替了传统的酸解法。本实验室从深圳海水中分离筛选到一株高活力的海洋琼胶降解菌2.2-g[2]，获得了具有较高活性的琼胶酶，本文对其基本酶学性质进行分析，以期为进一步工业化生产奠定理论基础。 1 材料与方法

1.1 培养基组成

1.1.1 2216Ｅ海洋细菌培养基(g/L)

蛋白胨 5，酵母膏 1，磷酸高铁 0.1，海水晶 33，

收稿日期：2008-07-22，

通讯作者：蔡俊鹏(1963-)，男，教授，主要从事海洋生物技术的研究

蒸馏水 1000 mL，pH 7.2。

1.1.2 2216E海洋细菌固体培养基(g/L)

在2216E海洋细菌液体培养基中加入0.6％的琼胶即为固体培养基。 1.1.3 发酵培养基(g/L)

琼脂2，其它成分同固体培养基。 1.2 Buffer A

6.06 g Tris碱，溶于700 mL水中，用浓盐酸调pH值为7.0，再加水定容到1000 mL。 1.3 DNS试剂：见文献[3]。 2 实验方法

2.1 菌体的扩大培养

将菌株接到含有20 mL 2216E发酵培养基的50 mL三角瓶中，27 ℃下180 r/min摇床培养20 h使菌株活化。将2 mL活化菌液转移到装有250 mL发酵培养基的1000 mL的三角瓶中，20 ℃培养19 h。一共培养4 L发酵液。 2.2 酶的分离纯化

发酵培养液在4 ℃ 6000 r/min离心30 min后除菌体，取上清，于上清液中缓慢加入硫酸铵至75％饱

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和度，4 ℃静置3 h，4 ℃ 6000 r/min离心30 min，弃去上清液，沉淀用适量的Buffer A溶解，4 ℃透析（分子量1.4 kDa）48 h后6000 r/min离心30 min，取上清液，即粗酶液。

粗酶液通过0.22 μm的微孔滤膜以除去杂质，上样于20 mmol/L pH 7.2 tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Cellulose 32柱进行离子交换层析，用20 mmol/L pH 7.2 tris-HCl缓冲液（内含0.4 mol/L的NaCl）洗脱，流速约为0.5 mL/min，分步收集洗脱液，收集的液体于280 nm测定吸光度，将收集的试管号对吸光度作图，测定峰位的酶活。将有酶活的峰位收集后，上样于20 mmol/L pH7.2 tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G100凝胶柱进行凝胶柱层析，用20 mmol/L pH 7.2 tris-HCl缓冲液洗脱，流速约0.3 mL/min，分布收集洗脱液，收集的液体于280 nm测定吸光度，将收集的试管号对吸光度作图，测定峰位的酶活。 2.3 酶活力的测定

反应体系：酶液200 μL，Buffer A配制成的含0.3%琼胶的底物溶液800 μL，55 ℃反应0.5 h，水解产生的还原糖采用DNS 法测定[5]。

酶活力单位定义为55 ℃，pH 7.0时1 mL酶液每分钟产生1μg还原糖(以半乳糖计) 所需要的酶量。 2.4 酶蛋白分子量的测定

测定方法为SDS-PAGE法[4]。 2.5 琼胶酶最适反应条件的确定 2.5.1 酶反应的最适温度的确定

按2.3所述，酶与底物混合液分别在40、45、50、55和60 ℃下反应，测定琼胶酶活力，并以灭活酶液在上述不同温度下测定酶活作为空白值。以所得最大酶活值为100计算其它条件下的相对酶活力，作相对酶活力-温度曲线。

2.5.2 酶反应的最适pH值的确定

按2.3所述，将酶与底物分别在pH值为5、6、7和8条件下反应，测定琼胶酶活力，并以灭活酶液在不同pH下测定酶活作空白值。以所得最大酶活值为100，计算其它条件下的相对酶活，作相对酶活力-pH曲线。

2.6 酶反应的底物专一性的确定

用0.3%琼胶、0.5％褐藻胶、0.5％岩藻多糖、0.5％卡拉胶、0.5％纤维素等不同的底物代替琼脂进行DNS反应，并按2.3所述以灭活酶进行空白试验。 2.7 温度对酶稳定性的影响

适量酶液分别在50 ℃、55 ℃和60 ℃保温11 h，并在保温经历0、0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h和11

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h时取样，测定酶活力，并以0 h的酶活为100，其它

酶活力与之相比计算相对酶活力，作相对酶活-时间图。

2.8 pH值对酶稳定性的影响

适量酶液分别在pH值为6、7和8下保温20 h，并在保温经历0 h、4 h、6 h、8 h、10 h和20 h取样，测定酶活力，并以0 h的酶活为100，其它酶活力与之相比计算相对酶活力，作相对酶活-时间图。 2.9 底物浓度对酶促反应的影响

按2.3所述，将酶与不同浓度的底物溶液(0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%)混合测定酶的活力，并以灭活酶液与上述不同浓度底物反应作为空白样值，做相对吸光度-底物浓度图。 2.10 不同金属离子对酶反应的影响

将下述试剂添加到Buffer A中代替按2.3所述的Buffer A进行酶活力的测定。EDTA、MgSO4、MnSO4、(NH4)2SO4、CaCl2、ZnSO4、SDS, 每种试剂添加的浓度为1 mmol/L。以未添加以上试剂的酶测定酶活，并以此值为100，其它酶活与之相比计算相对酶活。 2.11 琼胶寡糖的酶法制备

取3 g琼脂糖溶于1000 mL Buffer A中，冷却至55 ℃后加入5 mL琼胶酶液，于55 ℃保温并搅拌(100 r/min)24 h，然后用旋转蒸发仪于40 ℃下浓缩至原体积的1/5，向浓缩液中加入3倍体积冰冷的无水乙醇，4 ℃静置2 h使琼胶酶沉淀后，4 ℃下8000 r/min离心30 min，取上清液于40 ℃旋转蒸发至约50 mL，将此浓缩液冷冻干燥得到琼胶寡糖粗样品。 2.12 琼胶寡糖的初步纯化

取2.11所得冷冻干燥的粗寡糖样品适量溶于2.0 mL双蒸水，过0.22 μm膜后上样于Sephadex G25色谱柱(70 cm×1.0 cm)，室温下以蒸馏水进行洗脱(0.06 mL/ min)。部分收集器收集洗脱液(1 mL/管)。并按用DNS法测定洗脱液中还原糖在540 nm波长下的吸光值，绘制吸光值－管数图，得到寡糖的分离图谱。将具有还原糖的各峰分别收集，并冷冻干燥得到初步纯化的琼胶寡糖。

2.13 琼胶寡糖的结构鉴定

2.13.1 寡糖分子量的ESI-MS检测： 取2.11所得冷冻干燥寡糖样品适量溶于光谱醇甲醇，内含0.1％的醋酸。样品过0.22 μm膜后经蠕动泵直接向ESI电离源进样，进样速度3 μL/ min。ESI-MS操作参数如下：Capillary Voltage 3 kV, Cone Voltage 40 kV，Extractor Voltage 5 kV, Source Temperature 110 ℃, Desolvation Temperature 300 ℃。以正电荷模式收集质子峰。

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2.13.2 寡糖结构的13C-NMR测定：因为琼胶寡糖中的组成单元为D-半乳糖和3,6-内醚-L-半乳糖，这些结构为已知，现在未知的是琼胶酶以何种方式降解两者之间的糖苷键，降解β(1→4)糖苷键则得到以D-半乳糖为还原端的新琼寡糖，降解α(1→3)糖苷键则得到以3,6-内醚-L-半乳糖为还原端的琼寡糖。总之，两者之间的显著差别就在于还原性末端的不同，而正是这种还原性末端的不同造成了13C-NMR图谱上的信号存在显著不同的点[5~6]。因此，不同琼胶寡糖的区分可以借助13

C-NMR实现。将所得冷冻干燥的寡糖样品30 mg溶于0.5 mL重水，置于5mm的核磁管，核磁共振仪在室温条件下，磁场频率为125.8 MHz下工作，其它工作参数为：spectral widths 3.14 kHz，pre-scan-delay 6.0 μs，acquisition time 0.26 s，scans 3114。化学位移以ppm的形式表现有核磁共振的图谱上，根据化学位移来判断产物的结构。 3 结果与讨论

3.1 酶的纯化

对盐析和透析的酶液按标准方法测定其酶活，将收集的试管号对吸光度作图，如图1所示。

3.2 酶的最适反应条件的确定 3.2.1 酶促反应的最适温度

由图3可见，酶促反应的最适温度为55 ℃，超过55 ℃，酶活开始下降。

图3 温度对酶活的影响

Fig.3 Effect of temperature on agarase activity

3.2.2 酶促反应的最适pH

图4 pH值对酶活的影响 Fig.4 Effect of pH on agarase activity

图1 不同收集试管在280nm的吸光度

Fig.1 Absorbency of the crude enzyme measured at 280nm

如图4所示，琼胶酶的最适pH为均为7.0，它接近琼胶酶产生菌所生长的海洋环境，这可能是菌种的环境适应性造成的。

3.3 酶反应的底物专一性

该酶对琼胶底物具有相对的专一性，对所选用的其它几种多糖均无作用，见表1。

表1 该琼胶酶对不同底物的利用情况

Table 1 Efficiencies of substrate utilization by agarase 底物 酶活/(U/mL)

琼胶褐藻胶 岩藻多糖 卡拉胶纤维素20.10 0 0 0

由图1可清晰看到两个洗脱峰，分别将两个峰的

收集液以琼脂为底物测酶活，结果第1个峰的酶活为20.1 U/mL，另一个峰的酶活接近于0 U/mL，因此判断其为杂蛋白，酶活为20.1 U/mL蛋白溶液判断其为所需的酶液，将该峰收集后浓缩蛋白酶通过SDS- PAGE电泳确定其分子量和组分，与标准蛋白进行比较得其分子量约为55 kDa(如图2)。

3.4 温度对酶稳定性的影响

图2 SDS-PAGE电泳结果

Fig.2 SDS-PAGE of the purified agarase protein

图5 温度对酶的稳定性的影响

Fig.5 Effect of temperature on agarase stability

从图5知，酶在50~60 ℃的工作温度下的稳定性较

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好，最适温度下保温时间在8 h内时，相对酶活大于80%，即使此温度下持续保温11 h，酶活仍保持在65%以上；在50~60 ℃内保温9 h，相对酶活仍大于50%。但是，相对而言，工作温度越高，酶活下降越快，这也符合酶热失活的基本规律。 3.5 pH值对酶稳定性的影响

表2 不同金属离子对琼胶酶活的影响

Table 2 Effects of ions, EDTA and SDS on agarase activity 金属离子或试剂Control相对酶活力/%

100

EDTA 25

MgSO4175

MnSO465

金属离子或试剂(NH4)2SO4相对酶活力/%

30

CaCl2 ZnSO4 SDS 150

30 0

注：表中金属离子或试剂浓度为1mmol/L，pH为7.0

3.8 琼胶寡糖的初步分离纯化

将经琼胶酶解产物通过Sephadex G25凝胶层析柱进行初步分离纯化，获得一个寡糖的混合组分(图8)。

图6 pH值对酶稳定性的影响 Fig.6 Effect of pH on agarase stability

图8 琼胶寡糖在Sephadex 25凝胶柱上的层析结果 Fig. 8 Gel chromatography of the enzymatic products

(oligosaccharides) through Sephadex 25

图6为琼胶酶在工作pH值条件下的酸碱稳定性。从图6中可以看出，琼胶酶酸碱稳定性在最适pH值下较好。在最适pH下，当反应时间在6 h以内时，活力维持在80%以上。但是在非最适pH值条件下时，稳定性不好。如pH 6.0, 保持80%相对活性的稳定时间缩短到3 h。

3.6 底物浓度对酶促反应的影响

当琼脂浓度分别为0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%时，对酶促反应的影响如图7。

3.9 ESI-MS分析

图9 琼胶寡糖的ESI-MS谱图

Fig. 9 ESI-MS analysis of partially purified enzymatic products

of agarase 表 3 ESI-MS谱图分析

图7 底物浓度对酶促反应的影响

Fig.7 Effect of substrate concentration on agarase activity

Table 3 ESI-MS analysis of the major components of the

enzyme hydrolytic products

m/z

Quasi-ion

从图7知，当琼脂浓度小于0.3%时，随着琼脂浓度的增加，水解产生的还原糖的量也增加；但当琼脂浓度超过0.3%以后，随着底物浓度的增加，水解所得原糖的量不再增加，甚至还有小幅度的下降。因此，实验中最适琼脂浓度选择0.3%。

3.7 不同金属离子或试剂对酶反应的影响

结果见表2。Mg2+和Ca2+对酶促反应有促进作用，其中Mg2+的促进作用最为明显，相对酶活为175％；EDTA、Mn2+、NH4+、Zn2+、SDS等对反应有一定的抑制作用，特别是SDS的添加对该琼胶酶完全抑制。

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Agaro-biose Agaro-tetose Agaro-hexaoseMW=324

MW=630

MW=936

[M+Na]+ 347.22 653.35 — [M+Na+H]+ — — 960.50 [M+NH4]+ — — — [M+Na+NH4]+ 356.23 [M+Na+NH4+H]+

—

—

— — 982.45

[M+K]+ 372.21 669.31 —

708.34 — [M+2K]+ — 注：—为无信号

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琼胶寡糖中具有相同聚合度的糖，无论它是琼寡糖还是新琼寡糖，都是由相同个数半乳糖和3,6-内醚半乳糖组成，差别只在于次序不同。因此，它们的理论分子量都是一样的。经计算即为：琼二糖或新琼二糖理论分子量为324，琼四糖或新琼四糖理论分子量为630，琼六糖或新琼六糖理论分子量为936，琼八糖或新琼八糖理论分子量为1242，琼十糖或新琼十糖理论分子量为1548。初步纯化所得琼胶寡糖的ESI-MS的谱图结果如图9所示：由各信号峰所对应的寡糖理论分子理来推断，寡糖混合物较纯，基本不存在其它非寡糖物质的杂信峰。而且，信号峰谱图非常清晰，简单，归属容易，能准确判断出化合物的分子量。将图9中的质谱峰与不同聚合度的寡糖分子量相对应，其结果见图9和表3。

从图9与表3可知，初步纯化的琼胶寡糖组成为二糖，四糖和六糖。 3.10 13C-NMR结果分析

ESI-MS的结果只能反映寡糖的分子量，至于这些寡糖是水解α(1→3)键而得到的琼寡糖还是水解β(1→4)键而得到的新琼寡糖, 这只能联合13C-NMR的结果才能得出。所得寡糖样品经13C-NMR分析，结果如图10。

现代表半乳糖的还原端C原子的特征峰。因此，从图10可知，初步纯化的琼胶寡糖为新琼寡糖，从而也可以鉴定纯化所得的琼胶酶为β-琼胶酶。 4 小结

对海洋细菌Brevibacterium linens菌株产生的琼胶酶的基本性质作了研究。通过硫酸铵盐析、透析袋透析和柱层析，得到了电泳纯的琼胶酶样品，通过SDS-PAGE电泳，其分子量约为55 kDa。

确定了酶的最佳反应条件：酶反应的最适温度为55 ℃、酶反应的最适pH值为7.0。

＋＋＋

Mg2和Ca2对酶促反应有促进作用，其中Mg2的促进作用最为明显，相对酶活为175％；EDTA、

＋＋＋

Mn2、NH4、Zn2、SDS等对反应有一定的抑制作用，特别是SDS的添加对该琼胶酶完全抑制。

3 g琼脂经琼胶酶于55 ℃下降解24 h后，通过浓缩，酒精沉淀和Sephadex G25纯化得到琼胶寡糖混合物。寡糖混合物经ESI-MS和13C-NMR分析表明，该琼胶酶降解琼胶后得到由新琼二糖，新琼四糖，新琼六糖的混合物，也证明该琼胶酶为β-琼胶酶。 参考文献

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图10 琼胶寡糖的13C-NMR图谱

Fig. 10 13C-NMR spectrum of hydrolytic products of the

enzyme

真正特异性的C原子为寡糖中末端C原子，而这些特异性的C原子中，能显著区别琼寡糖与新琼寡糖的为还原性末端C原子。若为琼寡糖，则13C-NMR图谱中在约92.7 ppm处会有1代表3,6-内醚半乳糖还原端α-C原子的特征峰，而在96.0 ppm处不会有峰信号[7]。若为新琼寡糖，则在93 ppm和97 ppm分别出

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