TTC法

3TTC法

(1)TTC试验原理

TTC是取作为指示剂用的2、3、5-Triphenyte-trazoliumchloride(氯化三苯基四氮唑)的头一个字母的缩写，其原理是如果乳中有抗生素存在，则在向试样中加入菌种(嗜热链球菌)培养时细菌不增殖。此时，由于作为指示剂加入其中的TTC不还原，所以，仍呈无色状态。相反，如果没有抗生素存在，则加入的试验菌即行增殖，TTC还原变成红色，试样也随之染成红色。也就是说试样呈奶的原色时为阳性，染成红色时阴性。

(2)设备和材料水浴箱、温箱、1ml与10ml灭菌试管各2支、灭菌巧15x15mm试管3支，100℃温度计、蜡笔、试管架。

(3)培养基和试剂菌种嗜热乳链球菌、经113℃温度灭菌20min的脱脂乳。TTC试剂；称取2，3，5一氯化三苯基四氮唑1g，溶于25ml灭菌蒸馏水中，装人褐色瓶在7℃以下冰箱暗处保存。临用时用灭菌蒸馏水稀释至5倍。

(4)菌液制备将菌种移种脱脂乳，经36士1℃的温度培养15h后，以灭菌脱脂乳1:1的比例稀释待用。 (5)操作顺序

注:每份检样作2份，另外再作阴性和阳性对照各1份，阳性对照常用无抗生素的乳8ml，加抗生素及菌液和TTC，阴性对照常用无抗生素乳8ml加菌液和TTC。

微生物检测法的缺点是时间相对较长，状态判断通过肉眼辨别易产生误差，灵敏度低，操作相对复杂。其优点是费用低，一般实验室都能操作。 2.1氯化三苯四氮唑法(TTC试验)

本法是往检样中先加人菌液和TTC指示剂(2，3，5一氯化三苯四氮哇)，如检样中有抗生素存在，则会抑制细菌繁殖，TTC指示剂不被还原，不显色;如检样中无抗生素残留，则细菌大量繁殖，指示剂被还原而呈红色。 具体操作为:

2.2.1菌液制备。将嗜热乳酸链球菌接种人灭菌脱脂乳，置36℃士1℃培养箱中保温15h，再用灭菌脱脂乳以1:1比例稀释备用。

2.1.2操作步骤。取乳样9ml放人试管中→置80℃水浴中保温5min→冷却至37℃以下→加人菌液lml→置36℃士1℃水浴中保温2h→加入4%TTC指示剂0.3ml→置36℃土1℃水浴中保温30min→观察牛乳颜色变化。

2.1.3结果判定。检样呈红色或桃红色，说明无抗生素残留，即结果为阴性;如检样不显色，可再继续保温3Omin作第2次观察，如仍不显色，说明有抗生素残留，即结果为阳性。 1．3氯化三苯基四氮唑法(TTC法)

氯化三苯四氮唑法最早由Neel和Calbert2人在1955年提出。20世纪50年代TTC法是日本检测牛乳中青霉素残留的法定方法。该法1955年4月1日起在我国生效为法定方法。TTC法是我国鲜乳中抗生素残留检测的标准方法(GB4789．27-2008)第一法。其测定原理是:如果牛奶中有抗生素存在，当奶中加入菌种(嗜热链球菌)经培养后，菌种不增殖，此时加入

的TTC指示剂不发生还原反应，所以仍呈无色状态;如果没有抗生素存在，则加入菌种后，嗜热链球菌就生长繁殖，在新陈代谢过程中产生的氢，使无色的氧化型的TTC还原成红色的还原型的TTC，使样品染成红色，即牛奶的颜色不变为阳性，染成红色为阴性。由视觉判断[2]。该法简便、快速、无需特殊设备，很适合牧场、乳品场及食品卫生检测部门采用，该法的检测时间为2.5h以上，3-4h可见报告，各种抗生素的检测灵敏度（最低检出量）为：青霉素0.004U/mL，链霉素0.5U/mL，庆大霉素0.4U/mL，卡那霉素5U/mL。[3，4]1959年Parks和Doan认为,TTC法在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等,而对．．链霉素不敏感,对新霉素检测效果很差。也有认为消毒剂会干扰试验。1958年Dragon建议TTC法加做乳糖发酵产气及酵母培养试验可以证明抑菌的效果是由抗生素还是消毒剂引起。