＼辣椒求志剧Ｒ 。Ｆ ｃ Ａ ｃＡ吲ｃｕＭ ２０１６．３国外昧望 辣椒中ＡＢＡ介导的干旱胁迫响应相关基因 ＣａＤＲＴ１的鉴定与功能分析 Ｗｏｏｎｈｅｅ Ｂａｅｋ’Ｓｏｈｅｅ Ｌｉｍ’Ｓｕｎｇ ＣｈｕｌＬｅｅ （中央大学生命科学系， 首尔 １５６。７５６韩国） 摘要植物时常受到高盐和干旱等各种各样的环境胁迫，因此植物也进化出了各种防御机制以应对胁 迫所带来的毒害作用。脱落酸（ＡＢＡ）是一种植物激素，调控植物的生长发育并对非生物胁迫产生响应。 本研究从经ＡＢＡ处理的甜辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）叶片中鉴定出了一个耐旱基因ＣａＤＲＴ１（Ｄｒｏｕｇｈｔ Ｔｏｌｅｒｅｎｃｅ １）。ＣａＤＲＴ１基因在叶片中的表达受环境胁迫大幅诱导。经ＡＢＡ处理后，ＣａＤＲＴ１在辣椒叶片中 大量表达，表明ＣａＤＲＴ１蛋白在非生物胁迫响应中具有着重要功能。 通过病毒诱导基因沉默（ＶＩＧＳ）技术沉默ＣａＤＲＴ１基因后，叶片气孔关闭受限，蒸腾失水量上升，植株 受到显著伤害。ＣａＤＲＴ１过表达（ＣａＤＲＴ１一ＯＸ）的拟南芥在发芽期、幼苗期及成株阶段均呈ＡＢＡ敏感的表型。 此外，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株呈耐旱表型，其特点是气孔关闭程度高，蒸腾率低，叶片温度高，叶片中干旱应答基 因表达量增加。上述结果表明ＣａＤＲＴ１在ＡＢＡ介导的干旱胁迫响应中起正向调控的作用。 关键词 ＡＢＡ；ＣａＤＲＴＩ；干旱胁迫；辣椒；病毒诱导基因沉默 缩略词脱落酸 ＡＢＡ 定量逆转录聚合酶链反应 ｑＲＴ－ＰＣＲ ＳＯＳ 气孔开放缓冲液 花椰菜花叶病毒 ＣａＭＶ ＴＲＶ ＧＦＰ 烟草脆裂病毒 绿色荧光蛋白 ＶＩＧＳ ＭＳ 病毒诱导基因沉默 ＭＳ培养基 超表达 ＯＸ 能，因此与植物的胁迫耐性相关。渗透胁迫通常会 诱发组织中ＡＢＡ的产生和积累，且主要是在叶片 １ 背景 植物常暴露在不利的环境条件下，如干旱、盐 渍化、冷害和各种病原体等。为适应这些胁迫，植 物进化出广泛而复杂的防御系统，以将胁迫对其生 长发育的影响降到最小。干旱是一种重要的环境胁 迫，是根系缺水的普遍后果。为预防干旱的发生，一 组织中，这使植物对胁迫响应产生适应，包括气孔 关闭和胁迫响应相关基因的表达［４－６１ｏ在胁迫的诱 导下，大量沉默基因被ＡＢＡ激活。与其他的植物激 素相比，如生长素和赤霉素等，ＡＢＡ调节着大量基 因表达的重编程。１Ｏ％以上的拟南芥基因对ＡＢＡ 有响应［７－８］ｏ这些ＡＢＡ响应基因在提高抗旱性上 是要将蒸腾失水降到最低，二是要将根系吸水升到 最高ｎ。】。为适应干旱，植物进化出的防御系统能调 控胁迫响应基因的表达，进而使植物在形态学和生 具有重要作用。一些学者已经报道称ＡＢＡ缺乏或 ＡＢＡ响应突变体（ＡＢＡ响应基因被敲除的植株） 理学上产生变化。而干旱胁迫响应是一个复杂的过 程，由干旱引起的功能上的准确变化尚不为人知。 当植物遭遇干旱胁迫时，它们通过触发胁迫 容易受干旱胁迫的影响；此外，对这些突变体分析 后，ＡＢＡ信号通路中的多种重要成分被鉴定了出 来［４，９－１２］。ＡＢＡ响应基因的产物包含一些关键酶， 它们催化重要蛋白的合成，如转录因子、激酶、磷酸 信号网络来改变其原有的细胞程序。该过程始于脱 落酸（ＡＢＡ）作为胁迫信号被细胞接收。ＡＢＡ是 一种重要的植物激素，在不同的环境胁迫中都有功 酶和离子通道等，这些蛋白能在干旱胁迫下保护植 物细胞［５ 】，。其中，许多基因的功能已经被阐明了。 国外隙望２０１６．３ ＡＢＡ响应基因与多种防御机制相关，而其准确的功 ＯｕＲＮＡ 。Ｆ ＮＡ ｃＡ吲ｃｕＭ 椒求志 筛选。选择出的ＣａＤＲＴ１．ＯＸ转基因植株ＣａＤＲＴ１一 ＯＸ１和ＣａＤＲＴ１．ＯＸ２采用ＲＴ－ＰＣＲ验证其基因的 表达情况。 ２．３ ＲＮＡ提取与ｑＲＴ—ＰＣＲ 能却尚不清楚。 本研究鉴定出了甜辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ） 耐旱基因１（ＤＲｏｕｇｈｔ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ １，ＣａＤＲＴ１），该 基因编码一个未知的胁迫响应蛋白，并在甜辣椒 （Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）中作为干旱胁迫正向调控因 子。研究表明ＣａＤＲＴ１的转录由非生物胁迫诱导， ＲＴ－ＰＣＲ的总ＲＮＡ取自经ＡＢＡ、干旱、盐胁迫 处理的辣椒叶片，ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ的步骤附后。 提取的ＲＮＡ样品用不含ＲＮＡ的ＤＮＡ酶去除基 因组ＤＮＡ，于一２０℃保存。使用ｃＤＮＡ合成试剂盒 （Ｒｏｃｈｅ）进行ＲＴ－ＰＣＲ，步骤见说明书。同时，使用 ｑＲＴ－ＰＣＲ检测产物，以确定ｃＤＮＡ样品是否被基因 组ＤＮＡ污染。将得到的ｃＤＮＡ与ｉＱ 。ＭＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ和基因特异引物混合，在ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ 。Ｍ （Ｂｉｏ．Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，美国）中进行ｑＲＴ－ＰＣＲ反 包括脱水与高盐。为阐明非生物胁迫下ＣａＤＲＴ１ 功能缺失与功能获得，本研究分别在辣椒和拟南 芥中做了ＣａＤＲＴ１的沉默和超表达。研究发现， ＣａＤＲＴ１一沉默的辣椒植株呈干旱敏感的表型，其特 征为气孑Ｌ关闭受限，叶片蒸散偏高，叶片温度偏低。 相反，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ的拟南芥植株在整个生长时期 呈ＡＢＡ敏感表型。此外，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株呈耐旱 表型，表现为蒸腾速率偏低和胁迫响应标记基因表 达量升高。综上，本研究表明ＣａＤＲＴ１是ＡＢＡ介导 的干旱胁迫响应中的正向调控因子。 应。所有的反应重复３次，循环参数为：９５℃５ ｒｎｉｎ； ９５℃２０ Ｓ，６０℃２０ Ｓ，循环４５次；７５℃２０ Ｓ。ｑＲＴ－ ＰＣＲ至少设置２个生物学重复、３个技术性重复。 拟南芥和辣椒转录本的相对表达水平以内参基因 为参照，分别为Ａｃｔｉｎ ８和Ａｃｔｉｎ，。 ２．４亚细胞定位 ２材料和方法 ２．１ 植物材料与生长条件 辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．，ＣＶ．Ｎｏｋｇｗａｎｇ） 将融合了不含终止密码子的ＣａＤＲＴ１基因 ＧＦＰ二元载体ｐ３２６一ＧＦＰ转入农杆菌ＧＶ３ １ ０ １株系 和本氏烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）种子使用由堆 肥（泥炭苔、珍珠岩、蛭石，５：３：２，ｖ／Ｖ／ｖ）、沙和 壤土（１：ｌ：１，ｖ／ｖ／ｖ）混合的基质播种。植株生 长温度２４ｃＣ，光照由目光灯提供（１３０￣ｔｍｏｌ／ｍ２／ｓ， 光周期１６ ｈ，暗周期８ ｈ）。拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，生态型Ｃｏｌ一０）种子先用７０％的酒精消毒， 中。在含抗生素的ＬＢ液体培养基中筛选含目标载 体（ＣａＤＲＴ１一ＧＦＰ）的菌株，并于诱导培养基（１０ ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ ５．６；１０ ｒｎＭ ＭｇＣ１２；２００ ｐＭ乙酰丁 香酮）中重悬。细胞随后与ｐ１９株系混合，ＯＤ㈣ 达到０．５后侵染完全展开的本氏烟叶片。采用激光 共聚焦显微镜ＬＳＭ ７００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，德国）在４８８ ｎｍ波长下检测ＧＦＰ信号。 ２．５病毒诱导基因沉默 之后使用ＮａＯＨ处理１ ０ ｍｉｎ，随后使用无菌蒸馏水 冲洗ｌ０次，播种于含１％蔗糖的ＭＳ固体培养基上。 种子于培养箱中发芽，温度２４％，光周期１６ｈ，暗周 期８ ｈ。拟南芥幼苗培养条件与发芽条件相同。 ２．２ ＣａＤＲＴ１一ＯＸ转基因突变体构建 将ＣａＤＲＴＩ全长ｃＤＮＡ克隆到ｐＥＮＴＲ／ 用烟草花叶病毒（ＴＲｖ）介导的病毒诱导 基因沉默（ＶＩＧＳ）系统沉默辣椒中的ＣａＤＲＴ１基 因【１钔。为特异性沉默ＣａＤＲＴ１基因，ＣａＤＲＴ１ ｅＤＮＡ Ｄ—ＴＯＰＯ载体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中。采用ＬＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ将 基因整合到ｐＫ２ＧＷ７载体中，以花椰菜花叶病毒 （ＣａＭＶ）３５ Ｓ启动子驱动ＣａＤＲＴ１基因，使其稳 中一段２３７ ｂｐ的片段被插入到ｐＴＲＶ２载体中，构 成ｐＴＲＶ２：ＣａＤＲＴ１。分别使用含ｐＴＲＶ１、ｐＴＲＶ２和 ｐＴＲＶ２：ＣａＤＲＴ１的农杆菌（ＯＤ６ｏ０＝０．２）侵染子叶完 全展开的辣椒。侵染后置于培养箱中，温度２３℃，光 周期１６ ｈ，暗周期８ ｈ，以便病毒的增殖与传播。 ２．６脱水胁迫处理 定表达。测序后，使用热激法将正确的重组载体转 入农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ），采用蘸花 法进行拟南芥转化。收获拟南芥种子后，将其播种 在含５０ ｐｇ／ｍＬ卡那霉素的ＭＳ固体培养基上进行 Ｃ 尺丌一ＯＸ与ＣａＤＲＴ１．沉默植株的干旱耐 性通过测试水分损失率进行比较。每株拟南芥和辣 ４１ 谚 ＼ 椒求志。。ｕＲ 。Ｆ ｃ Ａ ｃＡ吲ｃｕＭ 椒分别取６～８片叶黄于培养皿中，在特定的时问 ２０１６．３国 ｝昧望 沉默的辣椒叶片，剥取表皮，在光照下将其浸于气 孑Ｌ开放缓冲液（ＳＯＳ，组成为５０ ｍＭ ＫＣＩ，１０ｍＭ ＭＥＳ．ＫＯＨ，１０ ｇＭ）中。孵育３ ｈ后，更换新的 ＳＯＳ蚪加入１０ ｇＭ或１ ５ ｇＭ的ＡＢＡ。孵育２．５ ｈ后， 进行气孔直径测量。每个实验重复３次。辣椒气孑Ｌ 孑Ｌ径测屋采用的是１叶或２叶的植株。 点测量其鲜重ｊ＝５｛失。耐旱实验取３周大的拟南芥幼 苗和４叶的辣椒茁进行处理［４Ｊ。脱水胁迫方法为断 水１０ ｄ后再恢复供水２ ｄ。 ２＿７叶绿素含量 用０ Ｍ和１Ｏ０ Ｍ ＡＢＡ处理野生型和 ＣａＤＲＴ１．ＯＸ拟南芥的叶片，７ ｄ后测定叶绿素含 量。处理期问，植株均在培养箱中培养，温度２４％， ３结果 ３．１ ＣａＤＲＴ１基因的分离和测序 光周期ｌ６ ｈ，暗周期８ ｈ。材料随后使用９５％乙醇 浸泡，于３７ 条什下持续振荡２ ｄ。叶绿素含量由分 光光度计测定，汁算公式为：Ｃｈ ＝（５．２４ Ｘ Ａ ）＋ 为鉴定非生物胁迫响应基因，我们从ＡＢＡ处 理和对照的叶片提取总ＲＮＡ进行了差异杂交筛选 分析 】。结果表明，ＣａＤＲＴ１在ＡＢＡ处理的叶片 ｆ：表达较对照显著增加。ＣａＤＲＴ１的ｃＤＮＡ含有一 个Ｋ为２７３ ｂｐ的开放阅读框，编码一条含７８个氨 （２２．２４ ｘ Ａ ）。其中ｃｈ 为叶绿素含量，单位为ｇｇ／ ｍＬ，Ａ为吸光值。每个处理重复３次。 ２．８热成像 ４周大的辣椒和３周大的拟南芥经５０ ＬｔＭ ＡＢＡ处理后用于热成像测定。热成像通过红外照相 机（ＦＬＩＲ系统；Ｔ４２０）获取，叶片温度通过ＦＬＩＲ Ｔｏｏｌｓ＋ｖｅｒ ５．２０软件测定。 ２．９气孔孔径测量 基酸的肽链，分子量为８．５６３ ｋＤａ，等电点（ｐＩ）为 ８．７６（ １）。氨基酸序列分析显示，ＣａＤＲＴ１蛋白 与其他蛋白质相似性不高（２９．４８７％～３１．１７９％）， 日．其功能尚不清楚。比对分析的结果显示了 ＣａＤＲＴ１蛋白（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＫＴ６９３３８４）与大 （Ｇｌｖｃｉｎｅ ｍａｘ，Ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ ００３５３７９１２．１）、 取５周大拟南芥的莲座叶和２周大基因瞬时 （Ａ）Ｃ ａｎｎｕｕｍ Ｇ ｍａｘ ＫＴ６９３３８４ ＸＰ Ｏ０３５３７９１２＿１ ＸＰ Ｏ０３６０６８６１１ ＮＰ ５６５３８４１ ＣＤＹ７０１２２ １ ＫＴ６９３３８４ ＸＰ Ｏ０３５３７９１２ １ Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｆａ Ａ ｔｈａｌｉａｔｌａ Ｂ．ｎａｐｕｓ Ｃ ａｎｎｕｕｍ Ｇ ｍａｘ 羽 翼 豪 ａｎａ） ∞∞惦∞柏 Ｍ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ａｌｔｈａｌｉａｎａ ＸＰ ００３６ｏ６８６１．１ Ｂ ｎａｐｕｓ ＮＰ ５６５３８４１ ＣＤＹ７０１２２ １ ——Ｚ一 』一ｘ 。。 图１辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）ＤＲｏｕｇｈｔ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｌ（ＣａＤＲＴ１）ｃＤＮＡ的序列比对 ＣａＤＲＴＩ蛋Ｃａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＫＴ６９３３８４）与大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ，Ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ ００３５３７９１２．１）、蒺藜苜 Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ５６５３８４． １）和油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ １）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ００３６０６８６１ｎａｐｕｓ，ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＣＤＹ７０１２２．１）的同源蛋ｃａ比较。黑色背景表示氨基酸相同 ４２ 国外嘹望２０１６．３ 蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ ５６５３８４．１）、 拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ， 。ｕＲＮＡ 。Ｆ ｃ Ａ ｃＡ吲ｃｕＭ辣椒求志／ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ ００３６０６８６１．１）和油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＤＹ７０１２２．１）同源蛋白的相 似性。 ３．２ ＡＢＡ、干旱及高盐处理对ＣａＤＲＴ１的诱导 为检验ＣａＤＲＴ１与非生物胁迫信号响应可能 存在的关联，我们分别检测了ＡＢＡ、干旱、高盐处理 后ＣａＤＲＴ１的表达水平（图２）。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果表 明，ＡＢＡ处理２ ｈ后，ＣａＤＲＴ１上调表达２．４倍， Ｃ ．Ｑ ３Ｏ ∞ ＣＯ 并在１２ ｈ后达到峰值；之后其表达水平逐渐降低 （图２ａ）。此外我们发现，干旱和高盐诱导辣椒叶片 中的ＣａＤＲＴ１大量表达。干旱和高盐处理２ ｈ后检 ． △ × ｎ） ∞ ２Ｏ 测到ＣａＤＲＴ１的表达量，处理后２４ ¨ ｃｏ一，Ｌ∞∞— ＿Ｊ△）（∞。＞ｌ１∞一∞ ｈ内其表达量 叭，Ｌ 逐渐增加（图２ｂ）。前人研究表明，ＮａＣ１是诱导植 ９ ６ ３ ０ ∞ 面 １０ 、， ｕｏｌ∞∞ｅＪｄ×∞∞言∞Ｉ． ａ ０ ５ ４ ３ ２ １ Ｏ 物细胞产生渗透胁迫的主要因子［】 。本研究发现， ＮａＣ１处理后的１２～２４ ｈ间，ＣａＤＲＴ１的转录水平 有轻微的升高（图２ Ｃ）。 ３．３ ＣａＤＲＴ１蛋白的亚细胞定位 我们将３５Ｓ启动子、ＣａＤＲＴ１和绿色荧光 蛋白（ＧＦＰ）报告基因连接制成融合表达载体。 ３５Ｓ：ＣａＤＲＴ１一ＧＦＰ融合蛋白在本氏烟表皮细胞的 细胞核与细胞质中均一表达（图３）。核定位情况与 细胞核ＤＡＰＩ染色观察时的蓝色信号一致。以上结 果表明，ＣａＤＲＴ１蛋白定位于细胞核与细胞质，且 在各位置均有功能。 ３．４ ＣａＤＲＴ１沉默导致辣椒植株耐早性减弱 Ｏ ２ ６ １２ ２４ Ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 图２ ＣａＤＲＴ１基因响应脱落酸（ＡＢＡ）和 非生物胁迫的表达水平 辣椒叶片经５０ ＡＢＡ（Ａ）、干旱胁迫（Ｂ）、２００ ＮａＣ１（Ｃ）处理后，不同时间点ＣａＤＲＴ１基因的ｑＲＴ－ 脱水处理后ＣａＤＲＴ１转录水平升高（图２ｂ）， 表明ＣａＤＲＴ１在干旱胁迫响应中具有功能。因此我 们采用了ＶＩＧＳ技术进一步研究ＣａＤＲＴ１在植株防 御响应中的作用ｎ 。用重组烟草皱曲病毒（ＴＲＶ： ＣａＤＲＴ１）和空载体（ＴＲＶ：００）分别注射辣椒子 叶，并用ＲＴ－ＰＣＲ验证ＶＩＧＳ的功能。结果表明， ＣａＤＲＴ１沉默以后，辣椒叶片中的ＣａＤＲＴ１表达水 平较低（附录图１）。为验证ＣａＤＲＴ１沉默是否造 成辣椒表型的变化，分别给予对照和ＣａＤＲＴ１一沉 默植株干旱胁迫（图４ａ）。水分充足的条件下， ＰＣＲ分析。ＣａＤＲＴ１的相对表达水平由１８Ｓ ｒＲＮＡ、Ａｃｔｉｎｌ 和ＥＦｌａ作为内参基因，且与对照叶片的表达水平进行比较。 数据由３个独立试验的平均值±标准误差所得 后ＣａＤＲＴ１一沉默植株恢复效果显著低于对照（图 ４ａ下）。恢复供水２ ｄ后，对照的存活率为６６．６％， 而ＣａＤＲＴ１一沉默植株的存活率仅为１４．２％。为研 究干旱表型与保水性的相关性，我们称量了离体叶 片的鲜重变化，并以此评估叶片水分蒸散量（图４ ｂ ｏ结果表明，ＣａＤＲＴ１一沉默植株水分损失较对 照更严重，表明ＣａＤＲＴ１一沉默植株的干旱损伤来 对照与ＣａＤＲＴ１一沉默植株间的表型没有差别（图 ４ａ左）。而断水１０ ｄ后，ＣａＤＲＴ１一沉默植株的萎 蔫情况较对照更严重（图４ａ中）。此外，恢复供水 自叶片蒸散量的改变。我们进一步研究了一个可能 使ＣａＤＲＴ１一沉默辣椒受到干旱伤害的生理机制。 ４３ 椒求志。。ｕＲ 。Ｆ ＮＡ ｃＡ ＧＦＰ ＤＡＰＩ Ｖｉｓｉｂｌｅ ２０１６．３国外隙望 Ｉ－－－ ０ Ｉ ◇ Ｉ Ｉ－ 簿Ｉ ｕ－ ０ 图３ ＣａＤＲＴＩ—ＧＦＰ融合蛋白在本氏烟草表皮细胞的亚细胞定位 使用叶盘法将３５Ｓ：ＣａＤＲＴＩ—ＧＦＰ和ＧＦＰ转化到本氏烟草中进行表达，使用核细胞染料ＤＡＰＩ 染色，使用激光共聚焦显微镜观察图中标尺表示１０ ｉｕｍ ＡＢＡ通过控制气孔大小求控制蒸腾述率．、…Ｊ 气孔 放．蒸发吸热，叶片濉度降低， 此我ｆｆＪ通过测量 …‘片温度来评估蒸腾火水量 实验表明， ２０ ｕＭ ＡＢＡ处理后，ＣａＤＲＴＩ一沉默辣椒的叶片涮Ｉｌｌ／ Ｓ＆ 著 低ｊ：埘照（ ４ Ｃ）熊腾速宰南气孔运动州１ ，且 ｌ１ｉ『人研究表｝月｛植侏埘ＡＢＡ的敏感性决定ｆ （ｅＬ直 子 ＾果 示ＣａＤＲＴ１一ＯＸ种了对ＡＢＡ 高度敏 感的表十 其发芽牢低丁野，ｌｉ， 的种子？与发芽阶 段卡¨比，野生 ＣａＤＲＴＩ—ＯＸ植株对ＡＢＡ响应 的箍异 什养生Ｋ阶段吏『Ｊｌ１明｛ＩＩ５－（ ５ｂ～ｄ） 外源 ＡＢＡ对｛』Ｊ，ｆ＝根的小利影响与尚水平的内源ＡＢＡ 是抑制 生根的生Ｋ的抑制 于，但其具体机制 ｊ 前尚小清楚［１９ ２１］ 我ｆ『Ｊ研究Ｊ 野生型和ＣａＤＲＴＩ— ＯＸ植侏 ＡＢＡ处理币¨对照情况下初生根的乍ｋ 情况 ．结果表日月，ＡＢＡ处删下ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株的 初 卜根受剑 著抑制（ ５ｂ 、１．０ ｌａＭ ＡＢＡ处理 Ｖ，Ｊ￣－Ｐ！ ＣａＤＲＴ１一ＯＸ柿株的仞牛根长度分别屉 ０．１ ｔａＭ ＡＢＡ处理的３８％和６％～８％（冈５ ｃ） 、此 人小 ”Ｊ。为判定ＣａＤＲＴＩ沉默降低Ｉ，涑做对 ＡＢＡ敏感性，我们测定 ｔ－ＹＬ直径一 ＣａＤＲＴ１一 Ｃ默辣椒 ｆ对照分别经１０“Ｍ币『Ｊ ２０ ｌａＭＡＢＡ处理后，气孔ｌ 径／ｆ 同，与叶片温度的结 粜一致（ ４ ｄ） 、ＣａＤＲＴＩ一沉默辣椒的 （４Ｌ卣径 大于对照，表明ＣａＤＲＴ１一沉默植株的大埘蒸做失水 足ＩＩＩ ＡＢＡ敏感性降低所敏ｊ ３．５ ＣａＤＲＴ１－０Ｘ植株在芽期、苗期和成株期对 ＡＢＡ的敏感性增强 外，经ｌ００ Ｍ ＡＢＡ处 后ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株叶片 的【ｌ ｒ绿素 量 著低于野牛 （ ５ｄ） ．结果表明， ＣａＤＲＴＩ 达提高了拟南芥 发芽阶段和营养生长 阶段对ＡＢＡ的敏感性．． ３．６ ＣａＤＲＴ１ ０Ｘ植株耐旱性增强 为验证ＣａＤＲＴＩ 体内的功能，我们使川ｔ ３５Ｓ 启动子构建厂ＣａＤＲＴ１的化椰菜花叶痫毒（ＣａＭＶ） 超表达载体，）ｉ－转化拟 芥 我们得剑丫两个独立 下ＣａＤＲＴ１一ＯＸ檀株 芽期和背养牛长期 埘ＡＢＡ离度敏感（图５）， 此我们推测ＣａＤＲＴ１ 在十旱胁迫响应中具有作川 为验证猜想．我们研 究了ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株是 埘ｆ：旱胁迫呈现不Ｍ Ｈ．ＣａＤＲＴ１表达 高（附录罔２）的Ｔ３纯合株系 （ＣａＤＲＴ１一ＯＸ），将曲者川于表型研究。ＡＢＡ信号 ｒ旱胁迫信 具有 川的信号转导途径，ｆｊｆ ｆ旱 胁迫信号不 依赖丁 ＡＢＡｌ 为俐 ＣａＤＲＴ１一Ｊ ＯＸ×ｌｆ ＡＢＡ的响应，我ｆ『Ｊ测定Ｊ ＡＢＡ处理后 的表型（ ６）。正常水分条件下，对照和ＣａＤＲＴ１一 ＯＸ植株ＩＩ＇｛Ｊ的表 没有差异（ ６ａ上）。然而 Ｉ，植 株断水ｌ０ ｄ后 ＣａＤＲＴＩ—ＯＸ植株的萎蔫情况较 野 型更轻（冈６ａ Ｉ１１）、此外，恢复浇水２ ｄ后， ＣａＤＲＴＩ—ＯＸ拟南芥的发芽率、根系生Ｋ状况和叶 绿素含量（陶５）、存分别含１．０、１．５、２．０ ｕＭ ＡＢＡ 的ＭＳ固体培养 【 播种ＣａＤＲＴ１一ＯＸ的拟南芥种 ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株较列‘照恢复得更好（图６下）。恢 国外晾望２０１６．３ ， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＡ ＣＡＰＳＩＣＵＭ ／Ｌ ｌＢｃｏ焉 ∞ｕ已ＪｌＪｏ 芭∞ （Ａ） Ｗａｔｅｒｉｎｇ 侣 １２ 一０／０一∞∞ｏｌＪ０ ≥ ｒｅ—Ｗａｔｅｒｌｎｇ ＿＿ ＞叱Ｊ－ Ｂｅｆ０ｒｅ ９ Ａｔ ４８ｈ ａｆｔｅｒ ３ Ｏ ｒｅ－ｗａｔｅｒｉｎｑ ００．． ＞ ＿ＳｕｒＬ ｖｉｖａｌ１．Ｊ＿ ｒ 口ｍｏ ａｔｅ 住 ６ ６６．６ ２７．２％ ＴＲＶ２：：００ ＴＲＶ２： ＣａＤＲＴ１ １４．２ １４．２％ —＿蕊 一ＴＲＶ２：：００——ｌ●一ＴＲＶ２：：ＣａＤＲＴ１ ｆＣ１ ＴＲＶ２：：００ ＴＲＶ２：： ＣａＤＲＴ１ ２５．８ —Ｄ／０— Ｌ丁匕ｍＱ∞一∞ ∞Ｅｏ＝ｌ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 加 ８ ０ ■ＴＲＶ２：：００ 一ＴＲＶ２：：ＣａＤＲＴ１ ＡＢＡ（ Ｍ） ０ １０ ０ １０ ２０ ＡＢＡ（ＢＭ） 图４干旱胁迫对ＣａＤＲＴＩ＋沉默辣椒的伤害程度加深 ｆＡ）空载体对照和ＣａＤＲＴ１一沉默辣椒植株经处理（植株在普通环境下栽培５周后断水１０ ｄ， 随后恢复供水２ ｄ）后的存活率；（Ｂ）空载体对照和ＣａＤＲＴ１一沉默辣椒离体叶片在不同时间点 的蒸腾失水量；（Ｃ）ＡＢＡ处理后，ＣａＤＲＴＩ一沉默辣椒的叶片温度降低；（Ｄ）ＡＢＡ处理后对照与 ＣａＤＲＴＩ一沉默辣椒植株的气孔直径；取３周大的植株叶片，剥取表皮，并分别浸泡于含０ ｌａＭ、ｌ０ Ｍ、２０ Ｍ ＡＢＡ的气孔开放缓冲液（ＳＯＳ）中。于显微镜下拍摄典型图片进行气孔直径测量 数 据由３个独立试验的平均值±标准误差所得＝星号表示在３个独立试验具有显著差异（Ｓｔｕｄｅｎｔ’Ｓ ｔ检验，ｐ＜０．０５） 复浇水２４ ｈ后，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ１和ＣａＤＲＴ１一ＯＸ１２ 的存活率分别为１００％和７３．３％，而野生型的只 有１３．３％。为研究干旱表型与叶片温度的相关性， ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株叶片的温度显著高于野生植株。 干旱耐性的定量测定一般取决于一些细胞 和分子的凶素，如蒸散失水、气孑Ｌ直径、叶片温度 和胁迫响应基因的表达量等。为确认ＣａＤＲＴ１一ＯＸ 我们测定了离体叶片的温度（图６ｂ），结果表明 ４５ 谚 、 椒求志 。ｕ只 。Ｆ ｃ川Ａ ｃＡ ｃｕＭ Ａ 【 ， ２０］６．３国９｝隙望 》 ＣａＤ尺７＿７．ｏＸ≠≠２ １ｏｏ 一０／０一ｕ０ｌｌｅ ｕＩＥＪａ０ ８ ０ —瓣一ＷＴ—・｝一ＣａＤ尺Ｔ１一ＯＸ撑１ ０ Ｏ ６ Ｏ ４ ０ ２ ０ ０ ８０ ６０ ４０ ２０ Ａ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １ ２ ３ ４ —０／０一Ｓ＾＾０Ｊ ｌｏｏ ５ ６ ７ ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ∞ Ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ∞ ∞ 加 ０ ∞ ∞ ∞ Ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 加 加 Ｄａｙｓ ａｖｅｒ ０ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ （Ｂ） ＷＴ ｃａＤＲＴ１．Ｏ× 撑１ ｊ！ｊ｝２ （、 Ｃ） 磁ＷＴ嘲≠磁 嘲≠≠１ ｊｆｊ｝２｝ （Ｄ） 疆ＷＴ秘撑１瀚撑２ ａ ａ ａ ｉ 、一 《 ∞ 《 ０ ≯ 一／＼／＼ 。．西Ｅ一一ｃ。一ｃｏ。＝ ＬＪＱ。Ｌｏ—ｃｏ ∞ ０ ０ ０ 牾 １ ０ ∞ Ｏ １０Ｏ ＡＢＡ（ｐＭ） ＡＢＡ（ｐＭ） 图５拟南芥ＣａＤＲＴ１超表达植株（ＣａＤＲＴＩ一０Ｘ）的ＡＢＡ敏感性增加 （Ａ）野生型（ｗＴ）与超表达（ＣａＤＲＴ１一ＯＸ）拟南芥种子经ＡＢＡ处理０～７ ｄ的发芽情况，种子于 分别含１．０、１．５、２．０ ｕＭＡＢＡ的１／２ＭＳ固体培养基上发芽；（Ｂ）ＷＴ和ＣａＤＲＴｌ—ＯＸ幼苗在分别含０、１ ０ ｕＭ ＡＢＡ的１／２ ＭＳ固体培养基上的长势，图片拍摄于种植１０ ｄ后；（ｃ）种植ｌ０ ｄ后的植株根系长度， 数据由３个独立试验的平均值±标准误差所得；（Ｄ）ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株成熟叶片对ＡＢＡ高度敏感。对４ 周大的植株喷洒０、１００ ｐＭ ＡＢＡ ３ ｄ，随后测量每株植株的叶绿素含量。数据由３个独立试验的平均值 ±标准误差所得。根据Ｄｕｎｃａｎ’Ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ，不同的字母代表ｐ＜０．０５的显著差异 植株耐旱性增强是由于其保水能力的提升，我们 处理下，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ和野生型植株的气孔大小没 测定了离体叶片的鲜重变化（图６ｃ）。结果显示 ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株鲜重损失 著低于野生型植株， 表明ＣａＤＲＴ１ ＯＸ植株耐旱性是取决于叶片蒸腾的 有显著差异。然而经１０ ｌａＭ或１５ Ｍ ＡＢＡ处 后， ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株的气孔显著小于野生型。结果表 明ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株对ＡＢＡ的高度敏感导致气孔 关闭数量升高。随后我们测定了ＣａＤＲＴ１一ＯＸ和野 速率。蒸腾失水量南气孔大小决定，且前人研究表 明内源ＡＢＡ水平与气孑Ｌ直径大小相关［２２］ｏ为确定 ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株蒸散失水较少是否南气孑Ｌ直径缩 小所致，我们分别检测了ＣａＤＲＴ１一ＯＸ和野生型植 株在ＡＢＡ处理和对照下的气孔直径（图６ｄ）。将表 生型植株的叶片温度。与脱水处理（图６ｂ）干日似， ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株叶片温度显著高于野生型（Ｉ ６ｅ）。为证明ＣａＤＲＴ１在干旱胁迫响应中的作州， 我们使用ｑＲＴ－ＰＣＲ分析了一些胁迫响应基【大１，如 ＡＢＦ２、ＲＤ２９Ａ、ＲＤ２９Ｂ、ＲＡＢ１８和ＣＯＲ１５Ａ（ ７）． ．皮浸于ＳＯＳ缓冲液中孵育，促进气孔打开。无ＡＢＡ 国外隙望２０１６．３ ＪｏＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩＮＡ ＣＡＰＳＩＣＵＭ （Ａ） 皇 堡 ！： ＃１ ＃２ （Ｂ） ＷＴ Ｄ ，ＣａＤ尺７－７．Ｏ× ≠≠１ 群２ ２８ ５ ０） ．三 ●●● 引剖 ０ ０Ｉ－ ●●，ｌ， ≥ ０＇ ＋Ｖ 雏 ａ） （２．９８） （０） （５．９６） 一Ｄ／０一 ０ｌａ≥ｃ∞ａＪ：ｌ 、＾厂ｒ ∞ ∞ ∞ 加 ∞ ∞ ∞ ∞ 撑１ 撑２ 豆ｌＩｕｌａｕ１ 芒∞。ｊ∞ ｏ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ Ｔｉｍｅ ａＲｅｒ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ（ｈ） 一 一。ｊ３ ０ ∞ｌＢｌＢＥｏｌｓ ●ＷＴ一撑１耥撑２ ∞ ∞ ∞ ∞ 一 一８Ｊｎ１ＢＪ∞ Ｅ ０ ４ ∞－１ ４ ｛己 孙 ２ ０ ８ ６ ２（Ｅ） ＡＢＡ（ Ｍ） 图６ ＣａＤＲＴＩ—ＯＸ拟南芥的耐旱性增强 ｆＡ１ ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株的耐旱性。２周大的ｗＴ和ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株断水ｌ０ ｄ．恢复供水２４ ｈ 后，植株的存活率；（Ｂ）３周大的ｗＴ和ＣａＤＲＴＩ—ＯＸ植株最大３片叶的平均叶面温度；（Ｃ）ｗＴ与 ＣａＤＲＴ１ ＯＸ植株离体叶片在不同时间点的水分损失情况；（Ｄ）ｗＴ与ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株经０ Ｍ、 １０ ＲＭ、１５州ＡＢＡ处理后的气子Ｌ孔径；（Ｅ）脱水后ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株叶片温度升高。取４叶期的植 株，去掉根部进行脱水胁迫处理，处理２ｈ后拍摄热图，并测量最大３片叶的温度计算平均叶片温度。 不同的字母代表ｐ＜０．０５的显著差异 ４７ 国外隙望２０１６．３ 响应。然而，ＣａＤＲＴ１一ＯＸ植株中胁迫应答基因表 达量升高不足以解释转基因植株在干旱胁迫下表 型的改变。需要更进一步的研究确定ＣａＤＲＴ１是否 直接参与胁迫应答基因表达的调控。 综上，该研究表明ＣａＤＲＴ１是一个新的小蛋 白，在辣椒中ＡＢＡ介导的干旱胁迫响应中作为一 个正向调控因子。并且，本研究通过揭示ＣａＤＲＴ１ 与气孔关闭的关联及胁迫响应基因的潜在联系，为 Ｊ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨｌＮＡ ＣＡＰＳｌＣＵＭ 椒求志 不清楚。进一步的研究确定ＣａＤＲＴ１的底物或者下 游基因有助于阐明ＡＢＡ和干旱的信号通路。 ５致谢 本研究由大韩民国农村发展管理局“农村合 作研究计划（项目编号：ＰＪ０１１０１００１）”资助。 ６作者贡献 Ｗｏｏｎｈｅｅ Ｂａｅｋ和Ｓｏｈｅｅ Ｌｉｍ参与了实验与数 据分析。Ｓｕｎｇ Ｃｈｕｌ Ｌｅｅ设计实验并撰写论文。 植物的干旱胁迫响应提供了有价值的见解。然而， ＣａＤＲＴ１作为干旱胁迫响应正向调控因子的机制尚 参考文献 ［１】 Ｙａｍａｇｕｅｈｉ・Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ［８］Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ，Ｙａｍａｓｈｉｎｏ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｄｉｕｍａｌｌｙ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ— ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄａｉｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ａｍｂｉｅｎｔ ｓ￣ｅｓｓｅｓ ｉｎ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ， ２００６，５７：７８１－８０３ ［２］Ａｐｓｅ Ｍ Ｐ，Ｂｌｕｍｗａｌｄ Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２００２，１３（２）：１４６—１５０ ［３］Ｃｏｃａ Ｍ Ａ，Ｄａｍｓｚ Ｂ，Ｙｕｎ Ｄ Ｊ，Ｈａｓｅｇａｗａ Ｐ Ｍ，Ｂｒｅｓｓａｎ Ｒ Ａ．Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ Ｍ Ｌ．Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ—ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，４９（３）：４８１－４８７ ［９］Ｍａ Ｙ，Ｓｚｏｓｔｋｉｅｗｉｃｚ Ｉ，Ｋｏｒｔｅ Ａ，Ｍｏｅｓ Ｄ，Ｙａｎｇ Ｙ＇ Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ Ａ，Ｇｒｉｌｌ Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ＰＰ２Ｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｎｓｏｒｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９， ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ３２４（５９３０）：１０６４—１０６８ ［１０］Ｕｍｅｚａｗａ Ｔ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｎ，Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ，Ｍｙｏｕｇａ Ｆ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ—Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ，Ｉｓｈｉｈａｍａ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａ ｐｌａｎｔ ＰＲ一５ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２０００， ２２（１）：６１—６９ ［４】Ｌｅｅ Ｓ Ｃ，Ｌｉｍ Ｃ Ｗ，Ｌａｎ ｗ，Ｈｅ Ｋ，Ｌｕａｎ Ｓ．ＡＢＡ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｅｎｔａｉｌｓ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＰＹＬ—ＲＣＡＲ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｉｏｎ Ｈｉｒａｙａｍａ Ｔ’Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ，ｇｙｐｅ ２Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００９，１０６（４１）： １７５８８．１７５９３ Ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ，２０１３，６（２）：５２８—５３８ ［５］Ｌｅｅ Ｓ Ｃ，Ｌｕａｎ Ｓ．ＡＢＡ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｒｏａｄ ｏｆ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ，２０１２，３５（１）：５３—６０ ［１１］Ｕｍｅｚａｗａ Ｔ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｎ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｆ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ Ｃ，Ｉｓｈｉｈａｍａ Ｙ，Ｐｅｃｋ Ｓ Ｃ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ［６】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ Ｉ，Ｋｗａｋ Ｊ Ｍ，Ａｌｌｅｎ Ｇ Ｊ．Ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｒｏｕｇｈｔ ｈａｒｄｉｎｅｓｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｓｃｉ Ｓｉｎａｌｇ，２０１３，６（ｒｓ８２７０） ［１２】Ｖｌａｄ Ｆ，Ｒｕｂｉｏ Ｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ａ，Ｓｉｒｉｃｈａｎｄｒａ Ｃ，Ｂｅｌｉｎ Ｃ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｎ，Ｌｅｕｎｇ Ｊ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｐ Ｌ，Ｌａｕｒｉｅｒｅ Ｃ，Ｍｅｒｌｏｔ Ｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ２Ｃ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１０（６８２６）：３２７－３３０ ［７］Ｇｏｄａ Ｈ，Ｓａｓａｋｉ Ｅ，Ａｋｉｙａｍａ Ｋ，Ｍａｒｕｙａｍａ—Ｎａｋａｓｈｉｔａ Ａ， Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｌｉ Ｗ，Ｏｇａｗａ Ｍ，Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｙ’Ｐｒｅｓｔｏｎ Ｊ，Ａｏｋｉ Ｋ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｔａｋａｔｓｕｔｏ Ｓ，Ｆｕｊｉｏｋａ Ｓ，Ａｓａｍｉ Ｔ， Ｎａｋａｎｏ Ｔ＇Ｋａｔｏ Ｈ，Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｈ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｎａｍｂａｒａ Ｅ，Ｋａｍｉｙａ Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ，Ｈｉｒａｉ Ｍ Ｓａｋｕｒａｉ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｎｆｌ—ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ＯＳＴ １ ｂｙ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌｎｔａ Ｃｅｌｌ，２００９，２１（１０）：３１７０—３１８４ ［１３］Ｌｉｍ Ｃ Ｂａｅｋ Ｊｕｎｇ Ｊ，Ｋｉｍ Ｊ Ｈ，Ｌｅｅ Ｓ Ｃ，．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＡ ｉｎ ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ Ｔ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ，Ｓａｉｔｏ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｔｈｅ ＡｔＧｅｎＥｘｐｒｅｓｓ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄａｔａ ｓｅｔ： ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ，ｄａｔａ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ｍｏｄｅｌ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２０１５，１６（７）：１５２５１—１５２７０ ［１４］Ｌｉｍ Ｃ Ｗ Ｌｅｅ Ｓ Ｃ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｐｅｒ ＭＬＯ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ，ＣａＭＬ０２，ｉｎ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎｄ ｄａｔａ ａｃｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００８，５５（３）：５２６—５４２ ４９ 蒋椒求志 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨｌＮＡ ｅＡＰＳｌＣＵＭ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１４，８５（１—２）：１－１０ 【１５］Ｌｉｍ Ｓ，Ｂａｃｋ ｗ，Ｌｅｅ Ｓ Ｃ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣａＤＩＮ １ ｉｎ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ２０１６．３国外隙望 ２００９，６０（５）：７５７—７７０ 【２４］Ｊｏｓｅｐｈ Ｍ Ｐ’Ｐａｐｄｉ Ｃ，Ｋｏｚｍａ・Ｂｏｇｎａｒ Ｌ，Ｎａｇｙ Ｉ，Ｌｏｐｅｚ— Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ Ｍ，Ｒｉｇｏ Ｇ，Ｋｏｎｃｚ Ｃ，Ｓｚａｂａｄｏｓ Ｌ．Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＺＩＮＣ ＦＩＮＧＥＲ ＰＲＯＴＥＩＮ３ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１４，８６（４—５）：５１３—５２５ 【１６］Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｃｕｉ Ｗｕ Ｌｏｕ Ｌ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｔｉａｎ Ｍ，Ｎｉｎｇ Ｓｈｕ Ｋ，Ｔａｎｇ Ｓ，Ｘｉｅ Ｑ．Ｔｈｅ ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ ＳＤＩＲ１ ｔａｒｇｅｔｓ ＳＤＩＲ１一ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮ１ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１４，１６５（３）：１２０３— １２２０ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ＡＢＡ ［２５］Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｅｒ Ａ，Ｈｉｒｔ Ｈ，Ｍｅｓｋｉｅｎｅ Ｌ．Ｐｌａｎｔ ＰＰ２Ｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，２００４，９（５）：２３６—２４３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１５，２７（１）：２１４— ２２７ ［１７］Ｌｉｍ Ｃ ｗ，Ｈａｎ Ｓ ｗ，Ｈｗａｎｇ Ｉ Ｓ，Ｋｉｍ Ｄ Ｓ，Ｈｗａｎｇ Ｂ Ｋ， Ｌｅｅ Ｓ Ｃ．Ｔｈｅ ｐｅｐｐｅｒ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＣａＬＯＸ１ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ［２６］Ｐａｒｋ Ｃ，Ｌｉｍ Ｃ ｗ Ｂａｃｋ Ｌｅｅ Ｓ Ｃ．ＲＩＮＧ ｔｙｐｅ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ ＣａＡＩＲ１ ｉｎ ｐｅｐｐｅｒ ａｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＢＡ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｓｍｏｔｉｃ，ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１５，５６（５）：９３０—９４２ ［１８】Ｊａｋａｂ Ｇ，Ｔｏｎ Ｊｊ Ｆｌｏｒｓ Ｖ，Ｚｉｍｍｅｒｌｉ Ｌ，Ｍｅｔｒａｕｘ Ｊ Ｐ，Ｍａｕｃｈ— Ｍａｎｉ Ｂ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓａｌｔ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１５， ５６（９）：１８０８—１８１９ 【２７】Ｐａｒｋ Ｓ Ｙ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｆ Ｃ，Ｍｏｓｑｕｎａ Ａ，Ｙａｏ Ｊ，Ｖｏｌｋｍａｎ Ｂ Ｆ，Ｃｕｔｌｅｒ Ｓ Ｒ．Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｗａｔｅｒ ｕｓｅ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１ ５， ５２０（７５４８）：５４５ 【２８］Ｋｉｍ Ｓ，Ｋａｎｇ ｊ Ｃｈｏ Ｄ Ｉ，Ｐａｒｋ Ｊ Ｈ，Ｋｉｍ Ｓ Ｙ＿ＡＢＦ２，ａｎ ＡＢＲＥ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｂＺＩＰ ｆａｃｔｏｒ，ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，１３９（１）：２６７—２７４ 【１９］Ｆｕｊｉｉ Ｈ，Ｖｅｒｓｌｕｅｓ Ｐ Ｅ，Ｚｈｕ Ｊ Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｂｓｅｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００７，１９（２）：４８５—４９４ ［２０］Ｊｉａｏ Ｓｕｎ Ｌ，Ｓｏｎｇ Ｙ’Ｗａｎｇ Ｌ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｌｉｕ Ｂ， Ｌｉ Ｎ，Ｍｉａｏ Ｃ，Ｈａｏ Ｆ．ＡｔｒｂｏｈＤ ａｎｄ ＡｔｒｂｏｈＦ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ—ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｃａ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｕｘｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｒｏｏｔｓ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，４０（１）：７５—８７ ［２９］Ｂａｋｅｒ Ｓ Ｓ，Ｗｉｌｈｅｌｍ Ｋ Ｓ，Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ Ｍ Ｆ．Ｔｈｅ ５＇－ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｏｒｌ５ａ ｈａｓ ｃｉｓ—ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒ ｃｏｌｄ一，ｄｒｏｕｇｈｔ・ａｎｄ ＡＢＡ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．［Ｊ１．Ｐｌａｎｔ ＭｏｌＢｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．， １９９４，２４（５）：７０１—７１３ ［３０］Ｈｕａ Ｚ Ｍ，Ｙａｎｇ Ｘ，Ｆｒｏｍｍ Ｍ Ｅ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮａＣ１一 ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＤ２９Ａ ａｎｄ ＲＤ２９Ｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．２０１３，６４（１４）：４１８３—４１９２ ［２１］Ｓｈａｒｐ Ｒ Ｅ，Ｐｏｒｏｙｋｏ Ｖ，Ｈｅｊｌｅｋ Ｌ Ｇ，Ｓｐｏｌｌｅｎ Ｗ Ｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｇ Ｋ，Ｂｏｈｎｅｒｔ Ｈ Ｊ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｈ Ｔ．Ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＭＡＰＫＫ ｏｒ ＭＡＰＫ ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，２００４，５５（４０７）：２３４３—２３５ １ 【２２】Ｊｅｏｎ Ｂ Ｗ，Ｈｗａｎｇ Ｊ，Ｈｗａｎｇ Ｓｏｎｇ Ｗ Ｙ’Ｆｕ Ｇｕ Ｂａｏ Ｆ，Ｃｈｏ Ｄ，Ｋｗａｋ Ｊ Ｍ，Ｙａｎｇ Ｚ，ＬｅｅＹ ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｍａｌｌ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＯＰ２ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｇｈｔ ｉｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ，２００６，２９（９）：１７６１—１７７０ ［３１］Ｌａｎｇ ｖ’Ｍａｎｔｙｌａ Ｅ，Ｗｅｌｉｎ Ｂ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ｂ，Ｐａｌｖａ Ｅ Ｔ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｓｔａｔｕｓ，ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｌ ８ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｇｈｔ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｏｍａｔａｌ ｏｐｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２００８，２０（１）：７５－８７ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９４（１０４）：１３４１－１３４９ ［２３］ＧｏｕＭ，ＳｕＮ，Ｚｈｅｎｇ Ｊ，ＷｕＧ，Ｚｈａｏ Ｊ，Ｈｅ Ｊ，ＴａｎｇＤ，Ｙａｎｇ Ｓ， Ｗａｎｇ Ｇ．Ａｎ Ｆ—ｂｏｘ ｇｅｎｅ，ＣＰＲ３０，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ 文献来源：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１６）９１：１４９—１６０ （华中农业大学园艺林学学院刘越孔秋生译） ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆｔｈｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，