(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108796037 A(43)申请公布日 2018.11.13
(21)申请号 201810614681.9(22)申请日 2018.06.14
(71)申请人 华中科技大学
地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路
1037号(72)发明人 欧小文 夏帆 娄筱叮 (74)专利代理机构 华中科技大学专利中心
42201
代理人 曹葆青 李智(51)Int.Cl.
C12Q 1/48(2006.01)G01N 21/64(2006.01)
权利要求书2页 说明书5页序列表1页 附图4页
CN 108796037 A(54)发明名称
一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒(57)摘要
本发明公开了一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒，属于生物检测领域。该检测方法为将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到缓冲液中，加入待测液后，所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下，扩增得到端粒酶重复片段；该端粒酶重复片段与核酸分子探针杂交，形成双链DNA；该双链DNA吸附带正电的聚集诱导发光化合物，使带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号，根据荧光强度得到端粒酶的活性。所述核酸分子探针的序列如SEQ ID No：4所示。检测端粒酶的试剂盒包含该探针分子。本发明所用探针无修饰，聚集诱导发光化合物信号灵敏度高，实际应用性强。
CN 108796037 A
权 利 要 求 书
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1.一种端粒酶的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到pH为6～8的缓冲液中，形成反应液；所述核酸分子探针为含有至少一个CCCTAA单链序列的DNA；
(2)将待测液加入到步骤(1)所述的反应液中，形成反应体系；该反应体系在30℃-60℃条件下充分反应；所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下，以dNTPs为原料，扩增得到端粒酶重复片段；所述端粒酶重复片段为含有至少一个TTAGGG序列的单链DNA；所述端粒酶重复片段与步骤(1)所述核酸分子探针杂交，形成双链DNA；该双链DNA吸附步骤(1)所述的带正电的聚集诱导发光化合物，使所述带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号；检测反应体系的荧光强度，根据荧光强度得到所述待测提取液中端粒酶的活性。
2.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法，其特征在于，所述带正电的聚集诱导发光化合物的结构式如式Ⅰ所示：
3.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸分子探针为茎环结构，所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列；
优选地，所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。4.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法，其特征在于，所述端粒酶引物片段的序列如SEQ ID No：1所示；所述核酸分子探针的序列如SEQ ID No：2所示。
5.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述带正电的聚集诱导发光化合物在步骤(2)所述反应体系中的浓度为20μM-80μM；步骤(1)所述核酸分子探针在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.5μM-1μM；步骤(1)所述端粒酶引物片段在步骤(2)所述反应体系中的浓度为1μM-5μM；步骤(1)所述氧化石墨烯在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.03mg/ml-0.06mg/ml。
6.如权利要求1所述的端粒酶的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的时间为30min-60min；步骤(2)所述检测反应体系的荧光强度的激发波长为340nm～380nm，发射波长为400nm～600nm。
7.一种核酸探针分子，其特征在于，所述核酸分子探针为茎环结构，所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列；
优选地，所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。8.如权利要求7所述的核酸探针分子，其特征在于，所述核酸分子探针的序列如SEQ ID No：2所示。
9.一种检测端粒酶的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求8所述的核酸探针分
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权 利 要 求 书
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子。
10.如权利要求9所述检测端粒酶的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括带正电的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs和RNase抑制剂。
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说 明 书
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一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种端粒酶的检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒。
背景技术
[0002]人类端粒酶是一种核糖核蛋白，它能够通过自身的RNA模板在端粒的尾端合成重复的TTAGGG片段。在正常细胞中，通过每一次的复制循环，端粒将逐渐变短，从而导致细胞衰老和死亡。相反地，在绝大多数种类的癌症细胞中，端粒的长度能够因为端粒酶的上调和激活而维持不变，这使得癌症细胞能够进行无限的分裂和增殖。同时，一些转移性癌组织也会有端粒酶活性上调的现象。因此，端粒酶被认为是一种有效的肿瘤标志物，对端粒酶活性的检测以及抑制将对癌症的早期检测，诊断以及治疗发挥着重要的作用。[0003]基于端粒酶的重要意义，目前也已经发展了多种荧光检测方法，这些方法能得到很好的准确度和灵敏度等，但往往也需要设计和合成带修饰的荧光核酸分子探针，这给检测工作带来了一定的成本和负担。因此，设计一种无修饰的核酸分子探针用于端粒酶的检测具有重要的研究意义。
发明内容
[0004]本发明解决了现有技术中端粒酶检测过程中核酸分子探针结构复杂、合成成本高以及制作困难的技术问题。
[0005]根据本发明的一个方面，提供了一种端粒酶的检测方法，包含以下步骤：[0006](1)将带正电的聚集诱导发光化合物、核酸分子探针、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs以及RNase抑制剂加入到pH为6～8的缓冲液中，形成反应液；所述核酸分子探针为含有至少一个CCCTAA单链序列的DNA；[0007](2)将待测液加入到步骤(1)所述的反应液中，形成反应体系；该反应体系在30℃-60℃条件下充分反应；所述端粒酶引物片段在具有活性端粒酶的作用下，以dNTPs为原料，扩增得到端粒酶重复片段；所述端粒酶重复片段为含有至少一个TTAGGG序列的单链DNA；所述端粒酶重复片段与步骤(1)所述核酸分子探针杂交，形成双链DNA；该双链DNA吸附步骤(1)所述的带正电的聚集诱导发光化合物，使所述带正电的聚集诱导发光化合物发出荧光信号；检测反应体系的荧光强度，根据荧光强度得到所述待测提取液中端粒酶的活性。[0008]优选地，所述带正电的聚集诱导发光化合物的结构式如式Ⅰ所示：
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[0009]
优选地，步骤(1)所述核酸分子探针为茎环结构，所述茎环结构环的部分含有至少
一个CCCTAA序列；[0011]优选地，所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。[0012]优选地，所述端粒酶引物片段的序列如SEQ ID No：1所示；所述核酸分子探针的序列如SEQ ID No：2所示。[0013]优选地，步骤(1)所述带正电的聚集诱导发光化合物在步骤(2)所述反应体系中的浓度为20μM-80μM；步骤(1)所述核酸分子探针在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.5μM-1μM；步骤(1)所述端粒酶引物片段在步骤(2)所述反应体系中的浓度为1μM-5μM；步骤(1)所述氧化石墨烯在步骤(2)所述反应体系中的浓度为0.03mg/ml-0.06mg/ml。[0014]优选地，步骤(2)所述反应的时间为30min-60min；步骤(2)所述检测反应体系的荧光强度的激发波长为340nm～380nm，发射波长为400nm～600nm。[0015]按照本发明的另一方面，提供了一种核酸探针分子，所述核酸分子探针为茎环结构，所述茎环结构环的部分含有至少一个CCCTAA序列；[0016]优选地，所述茎环结构茎的末端含有单链DNA序列。[0017]按照本发明的另一方面，提供了一种检测端粒酶的试剂盒，该试剂盒包含权利要求8所述的核酸探针分子。[0018]优选地，该试剂盒还包括带正电的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物片段、氧化石墨烯、dNTPs和RNase抑制剂。
[0019]本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：[0020](1)本发明反应体系中核酸分子探针和端粒酶引物片段由于共轭效应能够吸附在氧化石墨烯表面，少量带正电荷的聚集诱导发光化合物结合在带负电荷的DNA分子骨架上，聚集发出的荧光信号被纳米材料氧化石墨烯通过能量转移过程淬灭掉，因此背景荧光信号弱。将端粒酶加入到上述体系后，端粒酶引物片段能够扩增重复片段(TTAGGG)n，该重复片段能够与核酸分子探针杂交，形成梳状的双链DNA结构，该双链DNA结构脱离氧化石墨烯表面，且能够吸附大量的聚集诱导发光化合物，从而发出强烈的荧光信号，最终达到对端粒酶的高效检测。[0021](2)本发明引入带正电荷的AIE分子以及氧化石墨烯，设计无修饰的核酸分子探针，通过正电荷的AIE分子与负电荷的DNA骨架之间的静电结合作用以及氧化石墨烯吸附单链排斥双链和淬灭荧光的性质，即可完成荧光信号的强变化过程。整个过程不需要复杂的实验操作，灵敏度高，实际应用性强。[0022](3)本发明中核酸分子探针序列设计巧妙，茎环结构的核酸分子探针，能被延伸的
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[0010]
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端粒酶片段打开，形成梳状的双链结构；该探针无修饰，减少了大量的有机合成工作。[0023](4)发明利用聚集诱导发光(AIE)分子作为荧光信号分子，利用纳米材料氧化石墨烯(GO)降低荧光背景信号，从而实现了仅仅利用无标记的核酸分子探针(MB)，完成了对端粒酶的高效检测。[0024](5)本发明选用的带正电的聚集诱导发光化合物Silole-R是一种典型的AIE分子，它拥有两个正电荷，具有很好的水溶性。这些分子在溶液状态发出很弱的荧光信号，但是在聚集的状态下，却能够发出较强的荧光信号。与荧光分子相比，光稳定性较好，聚集诱导发光化合物聚集发光，光能不会损失，使检测结果稳定。附图说明
[0025]图1为检测端粒酶的原理图。
[0026]图2为分别向体系中加入裂解液、热灭活的端粒酶、经过端粒酶抑制剂处理的端粒酶以及有活性的端粒酶后体系的荧光变化曲线。
[0027]图3为不同个数子宫颈癌细胞(Hela细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。
[0028]图4为不同个数人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。
[0029]图5为不同个数人膀胱癌细胞(E-J细胞)中提取端粒酶后用于体系的荧光图谱和相应的荧光强度曲线。
[0030]图6为正常人尿液以及癌症病人清尿和血尿中的细胞提取端粒酶用于该体系后的检测结果统计图。
具体实施方式
[0031]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0032]本发明的基本原理为：利用带正电荷的聚集诱导发光分子作为荧光信号分子，纳米材料氧化石墨烯作为荧光淬灭基团，以及茎环结构的无标记核酸分子探针，完成对端粒酶的高效检测。反应开始前，体系中的端粒酶引物片段以及拥有部分单链的核酸分子探针吸附在氧化石墨烯表面，其吸附的带正电荷的聚集诱导发光分子发出的荧光信号被氧化石墨烯淬灭掉，因此背景信号低。加入有活性的端粒酶后，其引物片段能够扩增重复片段(TTAGGG)n，该重复片段能够与核酸分子探针杂交，形成梳状的双链DNA结构，该双链DNA结构脱离氧化石墨烯表面，且能够吸附大量的带正电荷的聚集诱导发光分子，从而发出强烈的荧光信号，最终达到对端粒酶活性的高效检测。[0033]实施例1
[0034]以检测Hela细胞中端粒酶的提取物，以及将提取物处理后作对照实验来进一步说明本发明。图1为检测端粒酶的原理图。[0035]步骤一：细胞中端粒酶的提取。取出培养状态良好的贴壁细胞，弃去其培养基，待
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PBS缓冲液洗净后，用胰蛋白酶进行消化，收集1×106个细胞于1.5mL的离心管中。将离心管放置在离心机中，用1000g的转速离心5分钟后，弃去其上层悬浮液，再次用PBS缓冲液清洗后，加入200μL的1×CHAPS端粒酶裂解液，重悬离心的细胞，同时将离心管放置于冰上30分钟后，在4℃的条件下用10000g的离心力离心20分钟。分装并保存上清液于-80℃的冰箱中。[0036]步骤二：于-80℃冰箱中取出端粒酶储存液，取出5μL储存液加热到95℃并保持在该温度15分钟，分别将5μL端粒酶裂解液，端粒酶提取液以及热灭活的端粒酶加入到45μL含有1×NEBuffer 2，1mM dNTPs，5μM TS primer，0.5μM MB，0.05mg/ml的氧化石墨烯以及0.4U/μL RNase抑制剂的混合溶液中，另外再将5μL端粒酶提取液加入到45μL含有1×NEBuffer 2，1mM dNTPs，5μM TS primer，0.5μM MB，1μM端粒酶抑制剂AZT，0.05mg/ml的氧化石墨烯以及0.4U/μL RNase抑制剂的混合溶液中。将上述处理好的溶液在37℃条件下孵育60分钟，反应完成后将体系用于荧光光谱仪的检测。[0037]步骤三：荧光检测。将样品放入10微升的石英比色皿中，设置参数为：激发波长360nm，发射波长400-600nm，狭缝宽10nm，检测电压600V。参数设置好后，收集图谱。图2为端粒酶提取物经过各种处理后用于体系的荧光图谱，从上往下分别是有活性的端粒酶、热灭活的端粒酶、经过端粒酶抑制剂处理的端粒酶和裂解液用于本发明体系的荧光图，可以得知，随着有活性的端粒酶、热灭活的端粒酶、经过端粒酶抑制剂处理的端粒酶和裂解液中端粒酶的活性逐步降低，荧光信号越来越弱。[0038]实施例2
[0039]以检测Hela，MCF-7，E-J细胞中提取的端粒酶并构建端粒酶浓度标准曲线为例，来进一步说明本发明。[0040]步骤一：Hela，MCF-7，E-J细胞中端粒酶的提取。提取过程同实施例1中的步骤一。[0041]步骤二：于-80℃冰箱中取出端粒酶储存液，用裂解液稀释成相对应个数细胞的端粒酶提取物，取出5μL加入到45μL含有1×NEBuffer 2，1mM dNTPs，5μM TS primer，0.5μM MB，0.05mg/ml的氧化石墨烯以及0.4U/μL RNase抑制剂的混合溶液中。将以上溶液在37℃条件下孵育60分钟，然后在95℃高温中放置15分钟以灭活端粒酶。反应完成后将体系用于荧光光谱仪的检测。[0042]步骤三：荧光检测。检测参数的设置同实施例1。图3，图4，图5分别为不同个数Hela，MCF-7，E-J细胞中提取出的端粒酶用于体系的荧光图谱和荧光变化曲线。从这三组图中可以看出，随着细胞个数的增加，荧光强度不断上升。[0043]实施例3
[0044]以检测正常人和癌症病人尿液中细胞提取端粒酶为例，来进一步说明本发明。[0045]步骤一：尿液的采集。用50ml离心管分别收集15例正常人尿液，以及来自同济医院泌尿外科提供的18例膀胱癌病人血尿和18例膀胱癌病人清尿。将样本储存在-80℃冰箱中用于实验。
[0046]步骤二：尿液中端粒酶的提取。将尿液解冻后置于4℃离心机中离心30分钟，弃去其上层悬浮液，用PBS缓冲液清洗后，加入100μL的1×CHAPS端粒酶裂解液，重悬离心的细胞，同时将离心管放置于冰上30分钟后，在4℃的条件下用10000g的离心力离心20分钟。取上层溶液用于体系的检测。[0047]步骤三：取5μL上述尿液细胞中提取出的端粒酶溶液加入到45μL含有1×NEBuffer
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2，1mM dNTPs，5μM TS primer，0.5μM MB，0.05mg/ml的氧化石墨烯以及0.4U/μL RNase抑制剂的混合溶液中。将以上溶液在37℃条件下孵育60分钟，然后在95℃高温中放置15分钟以灭活端粒酶。反应完成后将体系用于荧光光谱仪的检测。荧光检测参数设置同实施例1。图6为各种不同类型样本的荧光强度统计图。从图中数据可见癌症病人尿样细胞中提出的端粒酶活性要高于正常人。
[0048]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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序 列 表
<120> 一种端粒酶检测方法、检测核酸探针分子及检测试剂盒<160> 2<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1atccgtcgag cagagtt <210> 2<211> 57<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2aagctgaggt cttggacact accctaaccc taaccctaac cctaatagtg tccaaga 9
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说 明 书 附 图
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图2
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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