【摘要】 目的：用灭活法研制乙肝表面抗原(HBsAg)室内质控血清。方法：筛选HBsAg阳性血清，60℃加热1h进行灭活,同时与卫生部临床检验中心提供的HBsAg质控品比较,选取合适浓度的阳性血清作为ELISA法检测HBsAg的室内质控品。结果：该质控品定值为2 IU／ml和10 IU／ml。其稳定性实验表明：2～8℃3个月及-20℃保存6个月的含量无明显变化。均一性检测结果：瓶间不精密度为7.15%和8.97%。 结论:60℃加热1h灭活法制备的质控品可以作为用于ELISA法检测HBsAg的室内质控。
【关键词】 乙肝表面抗原（HBsAg）； 室内质控
Inactivated Method to Manufacture Internal Quality Control Serum of
Hepatitis B Type Virus Surface Antigen ( HBsAg)
FANG Yu-sen, YE Jing, WENG Xue-fen, et al
（The Hospital of Shantou University Medical College, Guangdong Shantou 515031, China)
Abstract: Objective: To assess the efficiency of inactivated method to manufacture internal quality control serum of hepatitis B type virus surface antigen (HBsAg). Method: The HBsAg positive serum samples with good quality were collected and inactivated by bathing at 60℃ for 1 hour, then mixed and diluted to proper concentration with the reference of control serum provided by the national center for clinical laboratory(NCCL), fractional packed in eppendolf tube and preserved in 2～8℃ refrigerator for assessment detection by enzyme linked
immunosorbent assay(ELISA). Result: The target titer value of the self-manufacture control serum was set to 2 IU/ml and 10 IU/ml respectively. Stability of these control serum was confirmed to preserving at 2 to 8 ℃ for 3 months and -20 ℃ for 6 months. Homogeneity test showed that the vail-to-vail imprecision was 5．53％and 8.97% respectively. Conclusion: These samples could be used as the internal quality control for HBsAg test with ELISA assay.
Key words: Hepatitis B virus surface antigen(HBsAg); Internal quality control
乙肝病毒（HBV）的慢性携带者约占我国人群的１０％～２０％。乙肝病毒可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可转为肝硬化甚至肝细胞癌（HCC），已成为严重的社会和公共卫生问题。目前国内基本上采用ELISA法检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg），但由于缺乏统一标准，国内目前并没有对免疫室内质控标准品—HBsAg的推广及普及，在实际操作中发现不同厂家生产的HBsAg试剂盒敏感性有差别，因而采用不同试剂检测得到的定性结果有较大差别。
研究制备室内质控品的方法很多，本课题前期研究认为60℃加热1h灭活法最好［1］。
为防止结果出现偏差，仅靠商品试剂盒配备的阳性和阴性对照，达不到控制各种因素造成的误差，给HBV感染的临床诊断和治疗检测带来了混乱，因此建立室内质控非常重要［2,3］，自制简便、经济、重复性、稳定性好的HBsAg的医院自用室内质控血清［4］， 提高检验质量，以适应科内日常检验工作者的需要。
本文将参照卫生部临床检验中心的标准和要求，研制出稳定性符合质控品要求的医院自用室内质控标准品—HBsAg［5］。
1 资料与方法
1.1 制备阳性血清的筛选:挑选Anti-HIV、Anti-HCV及RPR均性，无黄疸、无脂血、无溶血、血清标本至少6400ul的HBsAg阳性标本血清60份。其中汕头大学医学院附属肿瘤医院48例，汕头大学医学院第一附属医院12例。
1.2 制备:将 HBsAg阳性血清置60℃水浴加热1h进行灭活，灭活后组离心吸取上清液备用。
1.3 检 测
1.3.1 主要仪器：美国StatFax-2100酶标仪，美国StatFax-2600洗反机，IKA WERKE 磁力搅拌仪， METTLER TOLEDO PH测定仪。主要试剂：上海科华生物工程股份有限公司HBsAg诊断试剂盒，英科新创（厦门）科技有限公司HBsAg诊断试剂盒。以卫生部临检中心供应的2IU／ml HBsAg临界值血清作为参考品。
1.3.2 灭活效果实验：灭活后每份血清取2份用英科新创（厦门）科技有限公司HBsAg诊断试剂盒进行ELISA法作平行检测，检测过程严格按照说明书进行操作。
1.3.3 定值：将灭活后阳性血清全部混合，以卫生部临检中心供应的2IU／mlHBsAg临界值血清及罗氏公司提供的HBsAg异常质控血清作为参考品，进行ELISA法检测，六点非线性拟合做出标准曲线，依照待测物的吸光度（OD）值计算出相应待测物含量，应用稀释法调整浓度为2IU／ml 和10 IU／ml，分装量为每支0.2 ml，置2～8℃及-20℃冰箱保存。
1.3.4 稳定性实验：在不同时间抽取置2～8℃及-20℃条件保存下血清样本各三支，每份用ELISA法试剂盒检测，以卫生部临检中心供应的2IU／ml HBsAg临界值血清作为参考品，检测其含量的变化。
2 结 果
2.1 制备物靶值的确定:用生理盐水将制备物浓度进行对倍，4倍，8倍，16倍，32倍进行稀释，用ELISA法检测，先假定制备物浓度，并以试剂盒阴性对照作为0点，用美国StatFax-2100酶标仪进行六点非线性拟合定标，自动拟合标准曲线，检测卫生部临检中心提供的2IU／ml HBsAg临界值血清的测定值，根据测定值误差修正待测物假定值，再进行定标，直到卫生部临检中心提供的2IU／mlHBsAg临界值血清的测定值为2IU／ml为止（一般不超过三次），这时的假定值就是制备物的浓度，然后按照稀释法则把制备物稀释成浓度为2IU／ml和10IU／ml两种浓度的室内质控品，分装成200ul/瓶保存。
2．2 稳定性实验结果:不同条件下放置制备物的的稳定性进行长期监测，其结果见表1。表1 不同温度下保存稳定性试验结果
2.3 制备物的均匀性检测:表1 不同温度下稳定性试验结果(单位：IU／ml)2007年10月至2008年10月间2IU／ml和10IU／ml样本含量监测数据9次的数据进行统计，计算其均值、标准差和瓶间变异(表2)，该样本的瓶间差异为7．15％和8.97。符合均匀性要求(国家一级标准物质对均匀性的要求取决于使用要求)，其结果如下。表2 稳定性均匀性数据
3 讨 论
乙肝病毒表面抗原是诊断乙型肝炎的主要手段，目前，国内普遍使用ELISA定性法进行检测，ELISA定性法受反应温度、反应时间，交叉污染等多种因素影响，特别是对于低值弱阳性的判断缺乏统一标准，使得低值弱阳性结果不同实验室之间结果很难进行比较。为了解决这个问题，卫生部临检中心已经研制了用于进行HBsAg ELISA法检测国内标准品，单位为国际单位IU／ml。该标准物质已在许多三级医院得到广泛的应用，但价格偏贵，在许多中小医院仍没得到广泛的推广。室内质控的目的是使实验室测定结果趋于稳定。它应贯穿于分析前、中、后全过程，通过室内质控，详细掌握各阶段的变异，才能不断提高检验质量。因此推广使用室内质控极为重要。
本研究参照卫生部临检中心的制备方法，含量的确定针对低值弱阳性判断的2IU／ml和高浓度10IU／ml。因为ELISA法检测HBsAg浓度与吸光度之间呈“S”型曲线分布特征［6］，而2IU／ml是临床诊断的界限值，是室内质控精密度观察最敏感的窗口。同时，它还可以直接显示该试剂盒灵敏度是否达到2IU／ml、以防漏检，是提示试验成功与否的最重要标志。因此，我认为质控物最好选用2IU／ml。另外，为防止HOOK现象、最好同时进行高值质控10IU／ml。定值的准确性方面得到充分肯定。
所制备的质控标准物质，在稳定性方面进行长期监测（表1），分别做了2IU／ml 2～8℃和10IU／ml 2～8℃三个月、2IU／ml-20℃和10IU／ml-20℃6个月的含量变化监测，其结果与制备当天无明显差异，表明达到国际标准要求(Quality of biotechnolocal products：Stability testing of biotechnological／biological products；Quality．Guideline—Active Substance Guideline 3AB5a．1995)。均一性检测结果：瓶间不精密度为7.15％和8.87% ，且批内精密度和总精密度差异无统计学意义，达到了国家一级标准物质的要求(一级标准物质技术规范，JJG1006．1994)。
本文用60℃加热1h灭活法制备血清, 自制简便易操作、经济、重复性、稳定性好,用
于室内质控有很好的实用性,特别是中小医院更为合适。由于该定值制备物基质为普通急冻血清，在保存期限上较短，如果采用冻干血清，保存期限可延长。
【参考文献】
［1］ 方裕森，翁雪芬，叶靖，等. 乙肝表面抗原室内质控血清的研制［Ｊ］.实用医技杂志,2008,15(7):819-820.
［2］ 范秀芹，林凌云，岳志蹦，等. ELISA测定HBsAg室内质控问题的探讨［Ｊ］．中国煤炭工业医学杂志，2002,1:89-92.
［3］ 李金明,王露楠,徐锡霞,等. 室内质量控制对乙型肝炎表面抗原测定准确度的影响［Ｊ］. 中华检验医学杂志,2001,24:255.
［4］ 袁龙生,陈永健． 乙肝表面抗原定量检测的室内质控建立［Ｊ］． 浙江临床医学,2003,12:893-894.
［5］ 王露楠,吴健民,李金明,等. 丙型肝炎病毒核酸检测的国家标准物质的研制［Ｊ］. 中华检验医学杂志,2006,4:354-355.
［6］ 孙关忠．美国Abbott Axsym免疫分析仪性能初步评价［Ｊ］．21世纪论坛一浙江省检验医学学科发展和管理学术会议，2001，189-192．
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