一、 溶液的配制
1. Mandels营养盐溶液（1000 mL）
名 称
硫酸铵（(NH4)2SO4） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 尿素 （H2NCONH2） 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 氯化钙（CaCl2·2H2O）
注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。
重 量（g）
14 20 3 3 4
2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）
名 称
氯化钴（CoCl2·6H2O） 硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 硫酸锰（MnSO4·H2O） 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。
重 量（g）
3.7 1.4 1.6 5.0
3. DNS试剂的配制（1000 mL）
（1） 取：3,5-二硝基水杨酸 （C7H4N2O7） 7.5 g
氢氧化钠 （NaOH ） 14.0 g
充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min）
（2） 加入：酒石酸钾钠 （C4H4O6KNa·4H2O） 216.0 g 苯酚（在50 ℃水浴中融化） 5.5 mL
偏重亚硫酸钠 （Na2S2O5） 6.0 g
（3） 充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使
用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。 注意：倒入瓶中时要尽量装满！！
4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）
称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含0.01 %（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7 %（w/v）乙醇，8.5 %（w/v）磷酸。
5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）
名 称
柠檬酸（C6H8O7·H2O） NaOH
分 子 量Mn
210 40
重 量(g) 210 74.5
准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始pH4.45）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为4.8）
6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定
（1） 标准糖溶液的配制
准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 ℃烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。
取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。
取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5 mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。
（2） 标准方程的测定： ① 葡萄糖/木糖标准方程的测定
取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液1 mL，DNS溶液3 mL。100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）
② 酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）
取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）
③ 酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）
取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，测定CMC酶活力），摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）
7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制
pH 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 0.1 mol/L 柠檬酸/mL 19.60 18.76 17.82 16.83 15.89 15.06 14.30 13.56 12.90 12.29 11.72 11.18 10.65 10.14 9.70 0.2 mol/L 磷酸氢二钠/mL 0.40 1.24 2.18 3.17 4.11 4.94 5.70 6.44 7.10 7.71 8.28 8.82 9.35 9.86 10.30 pH 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 0.1 mol/L 柠檬酸/mL 9.28 8.85 8.40 7.91 7.37 6.78 6.15 5.45 4.55 3.53 2.61 1.83 1.27 0.85 0.55 0.2 mol/L 磷酸氢二钠/mL 10.72 11.15 11.60 12.09 12.63 13.22 13.85 14.55 15.45 16.47 17.39 18.17 18.73 19.15 19.45 注：Na2HPO4，Mr =141.98；0.2 mol/L溶液为28.40 g/L
Na2HPO4·2H2O，Mr =178.05；0.2 mol/L溶液为35.61 g/L C6H8O7·H2O，Mr =210.14；0.1 mol/L溶液为21.01 g/L
二、 酶活力的测定
1. 滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力
采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1 μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：
取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 × 6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）
项 目
稀释酶液（mL）
1# 0.2
2# 0.3 1.2
3# 0.4 1.1
4# 0.5 1.0
5# 0 1.5
6# 0.5 1
7# 酶解葡萄糖 标样1.5mL
0.05 M柠檬酸缓冲液（mL） 1.3
将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却后加水至50 mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550 nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：
滤纸酶活力 =
2 mg葡萄糖
60min×0.18(mg/μmol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）
一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。 备注：当加入0.5 mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2 mg葡萄糖时，按下式计算：
滤纸酶活 = 0.185 ×（葡萄糖mg数）
2. β-葡萄糖苷酶活力的测定 方法一：葡萄糖氧化酶测定法
按国际标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268]。一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1 μmol底物即生成2 μmol葡萄糖的酶量来表示。
预先用0.05 M的柠檬酸缓冲液配制15 mmol/L的纤维二糖溶液（0.513 g纤维二糖/100 mL0.05 M的柠檬酸缓冲液，现配现用） （1） 每个样品应做三个不同酶量
估计β-葡萄糖苷酶活力
（IU/mL）
取酶液量（mL）
（2） 加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下： 酶液量 （mL）
样品 酶液空白 纤维二糖空白
适量 1 0
0.05 M柠檬酸缓冲液（mL） 1－酶液 1 1
纤维二糖溶液 （mL） 1 0 1
< 0.1 0.5/0.8/1.0
0.1 0.3/0.5/0.8
0.2 0.2/0.3/0.5
0.3 0.1/0.2/0.3
每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。注意：纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。
（3） 酶解反应：试管置于50 ℃水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟
使酶失活，冷却至室温。
（4） 加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液30 µL，加入显色剂
3.0 mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取1 g/L葡萄糖标样30 µL，加显色剂3.0 mL，混匀；置于37 ℃水浴中，保温15分钟，取出。
（5） 测吸光度：505 nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A值。1g/L葡萄
糖标样的吸光度为0.7左右。
（6） 计算产生的葡萄糖mg数：
样 品 吸光度
测得 酶 空 白 所含葡萄糖 = 2 × （mg） 纤维二糖空白 1g/L葡萄糖标样吸光度
样品实际产生的葡萄糖 = [测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]
－[酶空白葡萄糖mg] × [酶液量mL] （mg）
注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。 （7） 作图：以log(酶液量mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图，
求出生成1 mg葡萄糖时对应的酶液量mL。 （8） 计算β-葡萄糖苷酶活力：
0.0926
β-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL）
生成1mg葡萄糖对应的酶液量（mL）
注：当加入1mL酶液仍不能生成1mg葡萄糖时，
β-葡萄糖苷酶活力 = 0.0926×（葡萄糖mg数）
☆ 补充：葡萄糖含量测定
采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R1（缓冲液）和R2（酶试剂），使用时将R1和R2等量混合。葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。测定方法如下： 在测定管中加入30 µL待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R1和R2等量混合的酶酚混合液3.0mL，将各试管分别摇匀，置于37℃水浴中保温15min，冷却至室温后，在7230分光光
度计上于505 nm下测定吸光度A值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：
测定管吸光度 葡萄糖含量（g/L）= × 稀释倍数 标准管吸光度
方法二： 采用pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）试剂测定
（1） 试剂的配制
① 50 mmol/L , pH 4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200 mL） 方法：0.1 mol/L柠檬酸 101.4 mL + 0.2 mol/L磷酸氢二钠 98.6 mL ② 1 mol/L Na2CO3溶液（250 mL）
称取：26.5 g Na2CO3溶解后定容至250 mL
③ 5 mmol/L pNPG（分子量：301.25）溶液的配制（100 mL）
称取0.1506 g pNPG，用50mmol/L，pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100 mL。
（2） 对硝基苯酚标准方程的测定 ① 对硝基苯酚标准溶液的配制
准确称取0.0209 g 对硝基苯酚（分子量：139.11），蒸馏水溶解，全部转移至100 mL容量瓶内，摇匀，配制成1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液。
取6个30 mL容量瓶，分别吸取1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L。 ② 对硝基苯酚标准方程的测定
取6支15 mL刻度管、6支1 mL刻度吸管，分别加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1.0mL，再加入2.0 mL 1 mol/L的 Na2CO3溶液和10 mL的蒸馏水，室温放置5 min后，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在400 nm下测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。 （3） 测定方法
游离酶酶活力的测定：0.1 mL适当稀释的酶液与0.9 mL 5 mmol/L pNPG溶液（分别预热5分钟）混合后，于50 ℃下保温10 min。 10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应后，再加入10 mL的蒸馏水，摇匀。 在400 nm下测定吸光度。以0.1 mL蒸馏水代替酶液作空白对照。（要做2～3个平行样，取平均值）
固定化酶酶活力的测定：将游离酶酶活的测定方法中0.1mL适当稀释的酶液用0.1mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤相同。 （4） 酶活力的计算
一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：每分钟水解生成1 µmol对硝基苯酚所需要的酶量。 计算公式如下： 游离酶酶活力的计算：
生成对硝基苯酚的量（µmol）
β-葡萄糖苷酶酶活 = （IU/mL）
10 min×0.1 mL
固定化酶活力的计算：
生成对硝基苯酚的量（µmol）
β-葡萄糖苷酶酶活 = （IU/g）
10 min × 称取固定化酶的质量（g）
3. 羧甲基纤维素（CMC）—内切葡聚糖酶活力
（1） 在25 mL刻度试管中加入0.5 mL适当稀释的酶液和1.0 mL用0.05 mol/L
柠檬酸缓冲液配制的1 %（w/v）羧甲基纤维素悬浮液。
（2） 盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃
下保温30 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在100 ℃沸水中煮沸5 min，冷却到室温后，加水定容至25 mL，充分摇匀后于550 nm波长下测定吸光
度A值。
（3） 反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。按下式计算CMC酶活力：
CMC酶活力 =
生成的葡萄糖的量（mg） 30min×0.18(mg/μmol)×0.5mL
一个CMC酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。
4. 木聚糖酶活力的测定
用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%（w/v）桦木木聚糖（Sigma公司制造）溶液。适当稀释酶液，取7支25 mL刻度试管按下表操作（5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照）。
项 目
稀释酶液（mL）
1# 0.2
2# 0.3 0.2 1
3# 0.4 0.1 1
4# 0.5 0 1
5# 0 0.5 1
6# 0.5 1 0
酶解木糖标样
1.5mL 7#
0.05M柠檬酸缓冲液（mL） 0.3 1%桦木木聚糖（mL）
1
将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温30 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却到室温后，加水到25 mL，充分摇匀后于550 nm波长下测定吸光度A值。根据木糖标准曲线（用木糖的绝对量对吸光度A值作图），找出反应所产生的木糖量（扣除空白值）。
以0.2、0.3、0.4、0.5 mL酶量所生成木糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg木糖的酶量，按下式计算木聚糖酶活力：
2mg木糖
木聚糖酶活力 =
30 min×0.15(mg/μmol)×生成2mg木糖的酶量
一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量，单位：IU/mL。
三、木聚糖的测定方法
1、准确吸取5mL搅拌均匀的木聚糖溶液于250 mL三角瓶中，加入5 mL 8 %的硫酸，摇匀后用牛皮纸和橡皮筋将三角瓶的瓶口扎住。
2、将三角瓶置于灭菌锅中于121 ℃条件下保温60 min，冷却后取出。 3、将三角瓶中的水解液倒入200 mL烧杯中，加入100 mL左右的水（注意少量多次洗涤三角瓶），用15 %的NaOH溶液中和至pH值为6.5 ~ 7.0。
4、将中和液定容到200 mL（量筒）。
5、用DNS法测得中和液的还原糖浓度c，则被测样品的木聚糖浓度C为：
C = c×40×0.9
式中：
C — 木聚糖浓度，g/L c — 水解液中木糖浓度 0.9 — 木聚糖和木糖的转化系数
6、每个样品做2个平行样。 注意：
木聚糖的聚合度是用c×40除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。
四、可溶性蛋白质的测定
采用Bradford测定方法。测定试剂采用Bradford试剂（Sigma公司）。
① 常量分析法。取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL），1个空白对照（蒸馏水）和所有待测试样各0.1 mL于10 mL具塞试管中，顺试管壁分别加入3.0 mL Bradford试剂，将试管小心上下翻转几次使液体混合均匀（注意尽量不产生泡沫），在加入染色剂后的5-60 min内，于595 nm波长下测定各样品的吸光度A值。以同样处理的空白作为对照。当蛋白质浓度在0.2-1.0 mg/mL范围内时，吸光度A值与蛋白质浓度之间呈线性关系。作出蛋白质浓度标准曲线后，由待测试样的A值可求得蛋白质的浓度。
②微量分析法。当蛋白质浓度较低时，可采用微量分析法来测定蛋白质浓度。取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白2、4、6、8和10 µg/mL）和待测试样各1.0 mL于10 mL具塞试管中，顺试管壁分别加入1.0 mL Bradford试剂，其余步骤与常量分析方法相同。
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