3.贵州省六盘水市水城区动物疫病预防控制中心 553600 4.贵州省威宁县农业农村局 553100 5.西南大学 402460
摘 要：为了探究荣昌区奶牛乳房炎葡萄球菌的种类及耐药性，对该地区来自不同奶牛场的78份奶牛乳样进行CMT诊断法检测、分离鉴定以及药敏试验。结果表明，78份乳样检测出有27份乳样患有乳房炎，对该27份样品进行分离鉴定出葡萄球菌16株，主要有金黄色葡萄球菌，溶血葡萄球菌，表皮葡萄球菌等；鉴定出的葡萄球菌对环丙沙星、诺氟沙星、多西环素、麦迪霉素和氧氟沙星高度敏感。
吸取每个乳样的100ul,倾注于兔鲜血平板和LB固体平板上，37℃温箱培养24h后，观察菌落形态，挑起可疑单个菌落少许进行下一步纯化后革兰氏染色，镜检,当出现蓝紫色葡萄串珠状的细菌初步怀疑为葡萄球菌。
将分离菌株分别进行凝固酶试验、溶血作用、产生色素、发酵木糖、发酵甘露醇、碱性磷酸酶、发酵麦芽糖相关试验等，置于37℃恒温箱中培养24h~48h，观察并记录结果。具体步骤参照东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》进行。
提取葡萄球菌基因组DNA进行PCR扩增，以基因组DNA为模板，反应引物为细菌16SrRNA基因通用引物。PCR扩增采用25µl体系：PCR酶12.5µl ,灭菌双蒸水8.5µl，提取的基因组2.0µl,上游引物1µl，下游引物1µl。反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s经35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察目的条带，结果照相保存；PCR产物按照PCR产物凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由公生物技术公司进行测序。
将培养好的葡萄球菌肉汤与0.5号麦氏标准管浊度进行比浊后，用灭菌好的涂菌棒将20uL葡萄球菌菌液均匀涂于整个平板表面。边涂边转动平皿重复3次，使得接种细菌充分的分布在营养琼脂平板表面，放置1～2min,倒置放于37 ℃培养箱中培养24h后用游标卡尺测量其纸片的抑菌直径。
关键词：奶牛乳房炎；葡萄球菌；分离鉴定；药敏试验奶牛乳房炎是由物理，化学或微生物等因素刺激侵入奶牛乳腺所引发的一种炎症反应，其发病率比较高，表现为奶牛产奶量下降，发情期延长，繁殖性能降低。而葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要的细菌之一，该菌在食物中被人摄入后，可引起食物中毒。
本研究是对荣昌区不同奶牛场的78份奶牛中检测有乳房炎的27份牛奶乳样进行细菌分离，并检测细菌对抗菌药物的敏感性，筛选出针对葡萄球菌的敏感药物，从而为奶牛乳房炎的防治，临床指导及葡萄球菌的耐药性研究，提供理论依据。
1 材料
普通琼脂培养基；兔血；高盐琼脂培养基；LB营养肉汤；革兰氏染色液；各类抗生素药物药敏纸片；细菌生化管；细菌基因组DNA提取试剂盒；PCR扩增反应试剂盒（宝生物工程有限公司）DNA胶回收试剂盒；DNA Marke；16S ；rRNA基因引物（由武汉金开瑞有限公司合成）。
立式压力蒸汽灭菌锅、电泳仪、梯度PCR仪、冷冻离心机、双人单面净化工作台、接种环、显微镜和移液枪等。
3 结果
3.1 CMT试验结果 78份乳样检测出有27份患有隐性乳房炎，部分结果如图1。
3.2 形态学观察 葡萄球菌在鲜血营养琼脂平板培养24h后出现圆形或者
图1 CMT试验判定
2 方法
随机采取荣昌区几个奶牛场的泌乳奶牛乳样78份。采集乳样之前先用温水来清洗乳房，并消毒乳头及和周围部分。收集样品时，弃掉前三把奶、后取10mL左右的乳样挤入灭菌好的试管中，标记好试管，并详细记录。
进行CMT试验来判断患有隐性乳房炎的情况，按照农业部所制定的进行诊断。《奶牛乳房炎防治技术指南（试行）》
*为通讯作者。
椭圆形凸起、光滑、湿润、表皮葡萄球菌菌落乳白或灰白，实心圆葡萄串状，该菌以单，双葡萄状排列，不透明，直径约1.5～2mm（图2）；在高盐琼脂上菌落特征生长初期基本同血液琼脂平板,金黄色葡萄球菌出现黄玉米色（图3）；镜检结果显示，该菌为革兰氏阳性菌（图4）
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该研究结果表明：一、用CMT试验检测出荣昌区患有隐性乳房炎奶牛的发病率为34.6%，发病率低于其他地区，这可能与荣昌奶牛养殖场近年来饲养管理水平提高有一定关
图2 图3 图4
系。二、检测的27份患有乳房炎奶样中共鉴定出葡萄球菌有16株，其金黄色葡萄球菌的检出率较低，可能是不同地区对奶牛乳房炎葡萄球菌的检出率不同。三、药敏试验结果显示：检出的葡萄球菌对环丙沙星、诺氟沙星、多西环素、麦迪霉素和氧氟沙星高度敏感，敏感率均在88%以上，对青霉素和多粘菌素B耐药。通过这次的研究结果可以为该地区奶牛乳房炎进行治疗并提供参考依据。
参考文献：
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（第二版）[4]王福兆主编.乳牛学[M] .北京:科学文献出版社,1993.[5]Philphot W N et al.Winning the Fight Against Mastitis.Westfalia.Surge,Inc.2000.
3.3 生化鉴定结果 经生化鉴定R3为金黄色葡萄球菌，R5为表皮葡萄球菌，R1为溶血葡萄球，RC4为腐生葡萄球菌。3.4 电泳结果 经16S rRNA基因扩增，获得凝胶电泳片段与目的片段大小相符（图5）。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，送至生物公司测序。3.5 药敏试验结果 根据2008年美国临床实验室标准化委
图5 PCR扩增的16S rRNA电泳结果
M：2000bpDNAMaker；1：RC-01；2：
RC-02；3：RC-03；4：RC-04；5：RC-05；6：RC-06；7：RC-07；8：RC-08；9：RC-09；10：RC-10；11：RC-11；12：RC-12；13：RC-13；14：RC-14；15：RC-15；16：RC-16；17：RC-17
员会（NCCLS）推荐的标准按敏感、中介、耐药三级报告判定。结果显示该16株分离菌对环丙沙星、诺氟沙星、多西环素、麦迪霉素和氧氟沙星等抗生素敏感性较高。
（上接131页）改造矫形钢板，将骨螺钉穿过接骨板按入骨体。剪除多余髓内针，将皮肤向上拉，使得髓内针位于皮肤之下，依次闭合肌肉层，结节缝合皮下组织，结节缝合皮肤。
本次治疗只对胫骨进行了复位及固定，而腓骨未做处理。猫后肢起主要支撑作用的为胫骨，腓骨受力较小，不会影响猫日后正常活动，且本次病例中腓骨无明显错位，断端相倚，会伴随胫骨的固定慢慢形成骨痂，后期可自行愈合。3.4.3 术后影像学检查 术后对患肢选取侧位进行X射线检查（图2），骨折断
端吻合良好，髓内针与接骨板固定牢固。3.5 术后护理及预后 术后8d内连续使用头孢哌酮和拜有利进行输液及皮下注射，用于抗菌消炎，预防感染。同时皮下注射美洛昔康、谷胱甘肽、促红细胞素，用于止痛、保肝、促进红细胞生成。并补充营养液直至术后第3d能够正常进食饮水，为病猫提供均衡的营养及安静的环境，有助于其修养。患肢外部用可鲁复合溶菌酶消毒喷剂消毒创部、百灵金方生肌散护理创口，一日四次。
术后第10d拆除皮肤手术缝合线，病猫各项生化指标均正常，可回家休养。但需定期拍X光片复查，以观察骨痂生长情况、髓内针及接骨板是否松动等。三个月后恢复良好可取出髓内针和接骨板。
谢失调等症状，骨折后主人应将宠物及时送到附近宠物医院就诊，以免错过治疗的最佳时期。
与大型动物相比，小动物骨骼较细，肌肉覆盖较少，外固定疗法虽具一定弹性，但易活动、有时固定不确实，应用于小动物临床疗效欠佳。而内固定疗法复位准确、固定确实，手术时严格遵循无菌操作，彻底清创，术前术中配合使用抗生素严防感染，能够实现一期愈合，预后良好。同时考虑到经济因素，髓内针配合接骨板进行内固定治疗已能够达到良好愈合条件，故不建议再外加固定。
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4 诊治体会
生活中动物骨折较常见，临床上小动物骨折常由高楼坠落、车祸、棍击导
图2 术后侧位X光
致，常伴随血容量降低、钙磷丢失、代
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