ＩＩ ｌ舭 ２０１５．６蔬 菜 细胞工程技术在花椰菜育种中的应用 胡立敏朱惠霞 陶兴林 （甘肃省农业科学院蔬菜研究所／农业部园艺 作物生物学与种质创制西北地区科学观测实验站 兰州７３００３） 摘要：植物细胞工程技术在花椰菜育种中起着重要的作用，主要从花椰菜的组织快繁、单倍体培养 及原生质体融合三个方面的研究进展进行了论述．分析了植物细胞工程在花椰菜遗传改良中的重 要作用，对今后细胞工程在植物遗传改良中的应用前景进行了展望。 关键词：花椰菜；基因工程；育种；应用 细胞工程是生物工程的一个重要方面．总的来 关键因子。但浓度过高对其具有抑制效应：在ＭＳ培 说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方 养基添加２ ｍｇ／Ｌ ２。４一Ｄ与３ ｍｇ／Ｌ ＣＴＫｓ可获得最佳 法，按照人们的设计蓝图．在细胞水平上进行的遗传 质量愈伤组织。同时高浓度ＣＴＫｓ有利于获得更多的 操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工 芽。Ｓａｓａｋｉ等（２００２）发现ＢＲ能够显著刺激不定芽产 程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细 生，ＺＴ与ｉＰＡ也促进芽再生，当ＣＴＫｓ与ＢＲ共同添 胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。利用细胞工 加时能够显著提高再生率。朱惠霞等（２０１０）研究了 程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个 ２个花椰菜品种的子叶和上胚轴的再生能力，发现子 方面。在常规的杂交育种中，育成一个新品种一般需 叶作为外植体时不定芽分化率低。子叶大部分发生 要８ １０年．而用细胞工程技术对杂种的花药进行离 黄化；而上胚轴作为外植体不定芽分化率较高，在适 体培养，可大大缩短育种周期，一般提前２ ３年，而 合的培养基上均能达到１００％，“祁连白雪”上胚轴最 其有利于优良性状的筛选。细胞工程技术在花椰菜 佳诱导培养基为ＭＳ＋６ＢＡ１．０ ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ０．５ ｍｇ／Ｌ，“新 育种方面具有其独特的作用，从组织培养、单倍体培 东海明珠８０天”的最佳诱导培养基为ＭＳ＋６一ＢＡ 养和原生质体融合等方面，对近年来细胞工程技术 在花椰菜遗传育种领域的应用进展作一介绍。 １．５ ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ０．５ ｍｇ／Ｌ。 ２单倍体培养在花椰菜育种中的应用 利用花药和小孢子等单倍体培养技术是加速花 １ 组织培养在花椰菜育种中的应用 组织培养技术是在无菌的条件下将活器官、组 椰菜育种材料纯化的重要方法，可直接用于育种，大 织或细胞置于培养基内。并放在适宜的环境中，进行 大缩短杂交后代的选择和纯化的过程，提高育种效 连续培养而成的细胞、组织或个体。目前国内外学者 率，缩短育种周期。花椰菜小孢子培养技术还不成 对花椰菜的基因型、取材部位、培养时间、培养基及 熟，基因型、取样时期、预处理和预培养等方面是主 激素等各因素影响进行了研究，应用子叶、子叶柄、 要的限制因素。 １ 基因型 下胚轴、花球、花托、花茎、花茎叶等外植体．成功获 ２．得完整再生植株。Ｍａｎｉｓｈａ等（２００１）通过愈伤组织途 基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键因素， 径获得了稳定的再生植株，２．４一Ｄ是愈伤组织启动的 不同基因型材料在相同试验条件下培养，胚状体产 基金项目：甘肃省科技支撑项目（１３０４ＮＫＣＡ１２９）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室。 作者简介：胡立敏，女，副研究员，研究方向为花椰菜育种。 一２８４— 蔬 菜２０１５．６ 舭 ｉＩ 量不同。杨清等（１９９０）以不同基因型花药为材料，发 热激温度与热激时间组合对花椰菜小孢子培养胚产 现培养基中加人硝酸银能明显促进体胚发生。且在 量有显著的影响，３２℃热激处理２４ ｈ．小孢子胚产量 浓度为１２５ ｍｇ／Ｌ时体胚产量最高。张晓芬等（２００５） 显著高于其他组合，这与Ｄｉａｓ（２００１）发表的结论相 以１２种花椰菜基因型为试材，进行游离小孢子培养 一致；而Ｄｕｉｉｓ等（１９９２）研究却发现３０ 处理４８ ｈ 技术研究．只有基因型Ｃ１成功地诱导出了胚状体并 最合适，方淑桂等研究认为３３℃处理４８ ｈ最适宜。 获得再生植株。方淑桂等（２００６）以８０份早中熟花椰 顾宏辉等（２００４）以Ｆ１为材料进行游离小孢子培养 菜栽培种为材料进行小孢子培养时，有２０份材料诱 可获得纯合的ＤＨ材料，３２ｃＩ二热激处理２４ ｈ对于小 导出胚状体，诱导率为２５％；基因型不同，产胚量差 孢子培养效果最佳：液体ＮＬＮ培养基中．蔗糖从 异也较大，产胚量最高每蕾平均３６个。最低的每蕾 １７．７％降至１０％，３２℃保温２４ ｈ可明显提高小孢子体 只有０－２个，相差１８２．５倍。赵前程等（２００７）在１８６个 胚发生，而且冷预处理可提高体胚质量。 花椰菜试材中，有５５个材料得到了小孢子胚，诱导 ２．４培养基成分 率２９．６％。顾宏辉等（２００７）以松花型Ｆ１杂种为材料， 蔗糖不仅作为碳源为游离小孢子提供能量并且 发现小孢子胚胎发生主要依赖于基因型，庆农６５ ｄ 还是小孢子的渗透调节剂．其浓度大小对小孢子存 每花蕾体胚产量最高（平均达１５．５个）；体胚萌发率在 活及是否发育成胚具有很大的影响。张晓芬等 ３０％左右．并自然加倍成二倍体。由此可见－／Ｊ、孢子胚 （２００６）在研究花椰菜游离小孢子培养时，比较了含 胎发生能力同其他遗传性状一样，是受基因调控的 １０％、１３％和１６％蔗糖的培养基的出胚率，结果显示， 遗传特性．对较难诱导的基因型，可通过与易诱导材 含１３％蔗糖的ＮＬＮ培养基胚胎发生率最高。 料杂交后再培养，提高胚诱导率。 激素的影响：在培养基中添加６一ＢＡ、ＮＡＡ对游 ２．２取样时期 离小孢子培养的影响已经有很多研究。在赵前程等 花蕾大小，即小孢子所处的发育时期，是影响出 （２００７）的研究中，当１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６一ＢＡ 胚的关键因素之一。植株发育状态直接影响小孢子 组合使用时，愈伤组织发育速度较快，愈伤组织质量 的生理生化特性和小孢子的发育方向，通常认为小 最好，能够进一步诱导获得胚芽。而６－ＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ＋ 孢子培养的最佳时期是单核晚期至双核早期。方淑 ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ的激素组合最适宜花椰菜胚胎愈伤组 桂（２００６）等以早中熟品种进行游离小孢子培养时， 织分化形成再生植株，愈伤组织分化率达到１００％， 取材前６ ｄ内气温１０ｃＩ＝～２Ｏ℃。盛花前期至中期花蕾， 平均每块愈伤组织的胚芽分化数量达到６．５２个。 选择单核靠边期至双核期小孢子，经３３℃热激处理 活性炭的影响：孙丹等（２００５）的研究表明，在培 ４８ ｈ后暗静置培养的产胚量最高。赵前程等（２００７） 养基中添加０．１０ ｍｇ／Ｌ活性炭能增加大多数品种的 在试验中以单核早期、单核靠边期、双核期和三核期 胚产量。原因可能是适量的活性炭可以吸附一些由 的小孢子进行培养，结果表明。单核靠边期到双核期 于胚胎滋生产生的代谢物质，从而促进胚胎发育。赵 的小孢子培养出胚率高，而在三核期和单核早期进 前程等（２００７）对花椰菜小孢子的研究表明，在胚胎 行花椰菜小孢子培养不能获得胚状体。这与方淑桂 转移到脱分化培养基的初期．添加１００ ｍｇ／Ｌ的活性 等的研究结果一致，盛花前期培养的小孢子产胚量 炭可以减少胚胎褐化、死亡，这个结果与姜凤英等 最高。比其他时期培养的高２０％以上，差异达极显著 （２００６）的研究结果相一致。试验中还发现，活性炭添 水平。 加在固体培养基表面比混合在培养基中效果更好。 ２．３预处理和预培养 韩阳等（２００６）研究发现，高浓度的活性炭对小孢子 为了提高花粉培养的效率，通常对试验材料进 胚的发生表现出抑制作用。 行预处理。预处理包括高温、离心、低温、射线、甘露 ３原生质体融合技术 醇或预培养等方式，其目的就是从生理生化上改变 通过远缘杂交将近缘植物的优良性状导人栽培 细胞生理状态、分裂方式和发育途径，有效地抑制小 作物，已经成为作物遗传改良的重要途径。但有些远 孢子的配子体发育途径，提高单核小孢子核对称分 缘杂交存在不能结实、生长势弱等缺点，原生质体融 裂的频率。顾宏辉等（２００７）的研究结果表明，不同的 合能很好解决这个问题。半个多世纪以来，国内外通 ——２８５—— １ ｌ书 过原生质体融合已经获得了大量芸薹属植物与近缘 植物的属间杂种。Ｖａｔｓｙａ等（１９８２）最早利用花椰菜幼 苗子叶的原生质体再生出植株。由下胚轴再生的植 株叶片分离的原生质体有较高的分裂活性和再生更 板固体培养、双层培养和ｇｅｌｒｉｔｅ包埋培养方法比较． 发现ｇｅｌｒｉｔｅ包埋培养最有利于下胚轴原生质体培 利用原生质体非对称融合技术获得了含有ｏｇｕｒａ雄 【Ｊ］．北方园艺，２０１０（９）：１４３—１４５． 究［Ｊ］．华北农学报，１９９０，５（３）：４８—５１． ２０１５．６蔬 菜 ｆ４１杨清，曹鸣庆，Ｃｈａｎｖｉｎ Ｊ Ｅ．冬花椰菜的小孢子胚胎发生研 【５】张晓芬，王晓武，张延国，等．花椰菜游离小孢子培养再生植 株研究『Ｊ］．中国蔬菜，２００５（１）：１６一ｌ７． ６］方淑桂，朱朝辉，曾小玲，等．花椰菜游离小孢子培养及影响 多新枝能力。卫志明等（１９９０）通过液体浅层培养、平 【因子［Ｊ】．福建农业学报，２００６，２１（２）：１３８—１４２． ［７】赵前程，吉立柱，蔡荣旗，等．花椰菜游离小孢子培养及植株 再生研究［Ｊ］．华北农学报，２００７，２２（６）：６５—６８． ＤＨ再生植株［Ｊ］，农业生物技术学报，２００７，１５（２）：３０１—３０５． 养，获得７８个正常生长再生植株。惠志明等（２００５） ［８】顾宏辉，朱丹华，杨加付，等．／Ｊ、孢子培养获得松花型花椰菜 性不育胞质的花椰菜再生植株。Ｋａｏ等（１９９２）使用青 花菜下胚轴原生质体与携带有ｏｇｕｒａ不育基因的线 粒体和ｅｔｒ叶绿体的Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ叶肉原生质体进 行体细胞杂交，得到的再生植株带有ｏｇｕｒａ不育基因 的线粒体，染色体数为２ｎ＝５６。Ｃｈｒｉｓｔｅｙ（１９９１）等用含 黑芥ＣＭＳ的青花菜叶肉原生质体与抗除草剂阿特拉 津的芜菁下胚轴原生质体融合获得了４株既表现 ＣＭＳ又抗阿特拉津的表型与青花菜相似的植株： Ｃｏｎｎｅｒ等（１９９７）利用此特性不育株系作母本，把阿 特拉津抗性作为遗传标记进行杂种种子生产以提高 制种效率。Ｚｈｏｕ（１９９７）等在油菜与青花菜原生质体 融合后的再生植株中得到了抗黑腐病植株。 ４展望 经过国内外学者多年的研究探索．花椰菜细胞 工程技术已越来越完善。尤其是小孢子培养技术有 了显著提高，这为游离小孢子的广泛应用奠定了基 础。游离小孢子培养技术可大大缩短育种年限，提高 育种效率，具有单细胞单倍性、群体数量多、自然分 散性好、不受体细胞干扰、便于遗传操作等优点。但 是还应看到，目前花椰菜游离小孢子培养在启动机 理、微观发育机制、发育途径等理论研究，以及与之 相关的外界环境对游离小孢子生长的生理生化方面 研究还十分欠缺，还没有建立起完善高效的再生体 系。所以今后应在花椰菜游离小孢子研究中，加强基 因型、微观发育调控和外界条件对花椰菜游离小孢 子生长发育的研究。 参考文献 【１］Ｍａｎｉｓｈａ Ｍ．，Ｓｈａｒｍａ Ｄ Ｒ．，ａｎｄ Ｋａｕｒ Ｒ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｌａｎ ｔｌｅｔ ｒｅ・ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｃａｕｌｉｌｆｏｗｅｒ ＣＶ．ＰＳＢ ＫＩ【Ｊ】． Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，２００１，２８（１）：９－１３． ［２］Ｓａｓａｋｉ Ｈ．Ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａ— ｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃａｕｌｉｌｆｏｗｅｒ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｓｅｇｍｅｎｔｓ【Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，２００２，７１（２）：１１１－１１６． 【３］朱惠霞，胡立敏，陶兴林．两个花椰菜品种再生体系的研究 ——２８６—— 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ｏｌｅｒａｃｅａ／Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｏｒｇａｎｅｉｌｅ ＤＮＡ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，１９９２，８３ （３）：３１３—３２０． 【２０］Ｃｈｒｉｓｔｅｙ Ｍ Ｃ，Ｍａｋａｒｏｆ Ｃ Ａ，Ｅａｒｌｅ Ｅ Ｄ．Ａｔｒａｚｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｙ— ｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ——ｓｔｅｒｉｌｅ——ｎｉｇｒａ ｂｒｏｃｃｏｌｉ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ－ｓｔｅｒｉｌｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ａｎｄ ａｔｒａｚｉｎｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｌｓ【Ｊ】．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐ１ Ｇｅｎｅｔ， １９９１，８３（２）：２０１－２０８． ［２１］Ｃｏｎｎｅｒ Ａ Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｙ Ｍ Ｃ．Ａ ｓｅｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ａｔｒａｚｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ【Ｊ１．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， １９９７．８０：５６１—５６４． 『２２］Ｚｈｏｕ Ｚ，Ｗｅｅｄｅｎ Ｎ Ｆ，Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｍ Ｈ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅ． ｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｂｌａｃｋ ｒｏｔ ｉｎ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｃｃｏｌｉ（Ｂ．ｏｌｅｒ一０）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ，１９９７，１９：１０９—１１０．