２２４ 新医学２０ｏ９年４月第４ｏ卷第４期 口腔鳞状细胞癌３ｐ２４等位基因杂合缺失的研究及序列测定 中山大学附属第三医院口腔科（５１０６３０） 金芮竹 蒋立坚 武警广东总队医院口腔科（５１Ｏ５０７） 靳华 ［摘要］ 目的：探讨３号染色体短臂２４区域ＥＡＢＭＤ（３ｐ２４ ＥＡ ＭＤ）位点等位基因 杂合缺失与口腔鳞状细胞癌（口腔鳞癌）的关系。方法：采用聚合酶链反应一限制性片段长度 多态性检测１００例口腔鳞癌患者的口腔正常组织和肿瘤组织中的３ｐ２４ ＥＡＢＭＤ位点杂合缺失情 况，并对杂合缺失阳性配对标本的等位基因片段进行克隆及序列测定。结果：１ｏｏ对标本中， 发现正常组织有信息个体４４份，其相应肿瘤组织出现杂合缺失２３份，杂合缺失率为５２％。 与正常组织限制性内切酶的ＭＤ位点的测序结果对照，杂合缺失的阳性克隆配对标本均发生点 突变。结论：口腔鳞癌组织中３ｐ２４ ＥＡＢＭＤ位点的杂合缺失率较高，常为点突变，提示该位点 附近可能存在潜在的口腔鳞癌抑癌基因。 ［关键词］ 口腔鳞状细胞癌 杂合缺失 等位基因 克隆 基因测序 聚合酶链反应一限制性片段长度多态性 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒ０ｚｙｇｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｌｌｅｌｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍ０ｓｏｍｅ ３ｐ２４ ｉｎ ｏｒａＩ ｓｑｕａ－ ｍｏｌｌｓ ｃｅＵ ｃａｒｃｉｎ０ｍａｓ． ｎ尺“ 『上， 口 Ｌ ｒ上ｎ，．， Ⅱ． ｅ Ｄｅｐ０ Ｑ厂５ ０，， ￡０ＺＤｇｙ， ｅ ｒｄ锄 把ｄ 脚 Ｚ ５ ｎ ｎ ，５ｌ０６３０， ｎｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉ０ｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌ０ｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（Ｌ０Ｈ） ｏｎ ｔｈｅ ａｌｌｅ１ｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＡＢＭＤ ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｈｍｍ０ｓ０ｍｅ ３ｐ２４（３ｐ２４ ＥＡＢＭＤ）ａｎｄ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅＵ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＯＳＣＣ）． ＭｅｔＩＩ硼ｓ：Ｔｈｅ ＤＮＡ ｆｒ０ｍ ｎｏｍａ１ ｔｉｓｓｕｅｓ ａＪ１ｄ ｎｅ叩１ａｓｍ ｔｉｓｓｕｅｓ ０ｆ １ ｏ０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉＩｈ ＯＳＣＣ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆ０ｒ ＬｏＨ ｏｎ ３ ｐ２４ ＥＡＢＭＤ ｂｙ ｐ０ｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ０ｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎ ｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）．ＰｏｓｉｔｉＶｅ ｓｐｅｃ— ｉｍｅｎｓ ０ｆ Ｌ０Ｈ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｉｔｈｉｎ ｌｏ０ ｃａｓｅｓ，ｔｈｅ ｆｌｒｅｑｕｅｎｃｙ ０ｆ ＬＯＨ ０ｎ ３ｐ２４ ＥＡＢＭＤ ｗａｓ ５２％（２３／４４）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ３ｐ２４ ＥＡ ＭＤ ０ｆ ｎ０瑚ａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａ－ ｔｉ０ｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａ１ｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｎｅｏｐｌａｓｍ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｌ０Ｈ． Ｃ０ｎｃｌｕ＿ｓｉＯｎ： ＬＯＨ ｏｎ ３ ｐ２４ ＥＡＢＭＤ ｏｃｃｕｒｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ０ＳＣＣ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｕｓｕａ１ｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ａ ｎ０Ｖｅｌ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐ— ｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ０ｆ ０ＳＣＣ ｍａｙ ｂｅ ｎｅａｒｂｙ ｔｈｅ ＥＡｐＭＤ ｓ ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｏｍｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒ０ｚｙｇｏｓｉｔｙ Ａｌｌｅｌｅ ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉ０ｎ—ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｌｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎ ｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ １ 引 言 列测定，为探讨该位点附近有否存在口腔鳞癌抑癌 在全球范围内，口腔癌的发病率居全身恶性肿 基因提供依据，现将有关结果总结报道如下。 瘤的第６位，其中以口腔鳞状细胞癌（口腔鳞癌） ２材料与方法 最为常见 ０ Ｊ。Ｂｍａｋｈｕｉｓ等 提出口腔鳞癌分子生 ２．１一般资料 物学机制的“单克隆起源”模型，认为基因改变 ２００５年６月一２００６年６月在中山大学附属第 可使单个正常细胞演变成具有成瘤性的恶性细胞。 三医院行外科手术治疗的口腔鳞癌患者１０ｏ例，均 近年来有报道提示口腔鳞癌相关基因可能定位于３ 经病理学活组织检查（活检）确诊为口腔鳞癌，所 号染色体。本研究应用分子生物学技术，对ｌ００例 有患者术前均未予化学治疗、放射治疗或其他治 口腔鳞癌患者的鳞癌组织的３ｐ２４ ＥＡｐＭＤ位点杂 疗。１０ｏ例中，男５７例，女４３例，年龄３０—８１岁， 合缺失情况进行了检测，并对该片段进行克隆及序 中位年龄６ｌ岁，病程２周一６个月。标本取其手术 现职武警广东总队医院口腔科（５１Ｏ５Ｏ７） 切除的新鲜肿瘤组织及癌旁组织（即正常组织，取 通讯作者 自距离肿瘤组织５ ｃｍ以外的黏膜）各１００份（共 新医学２０ｏ９年４月第４０卷第４期 １ｏ０对），所有标本取得后均保存于一７０ 待测。 ２．２ 方法 采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性 （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｉｅ－ａｃｔｉ０ｎ—ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ（）ｎ ｆ ａｇｎ１ｅＩ１ｌ １ｅｎｇｔｈ ｐｏ１ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）检狈０。 ２．２．１ 基因组ＤＮＡ的提取与目的基因片段的ＰＣＲ 扩增所有标本采用蛋白酶Ｋ消化，标准酚一氯仿 法提取组织ＤＮＡ，用ＴＥ缓冲液稀释，紫外分光光 度计定量后备用。３ｐ２４ ＥＡＢＭＤ引物为：上游５’一 ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴ一３’， 下游 ５’ 一 ＡＧＡＡＴＧｃＣＡＡＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＡ一３’ （委托上海生 工生物工程技术服务有限公司合成）。在５０ Ｌ的 ＰｃＲ反应体系中加入互补ＤＮＡ ５ Ｌ、三磷酸脱氧 核糖核苷（ｄＮＴＰ）５ 、１０倍扩增缓冲液５ Ｌ、 上下游引物各３ Ｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶ｌ Ｌ，加水 至终体积５０ Ｌ，然后９４℃变性３０ ｓ、６４ 退火 １５ ｓ、７２℃延伸ｌ５ ｓ，共３５个循环，最后１个循环 在７２ｃ【＝延伸７ ｍｉｎ，扩增目的基因片段为 ３ｐ２４ＥＡＢＭＤ。 ２．２．２ ＰＣＲ产物的酶切及杂合缺失的判定 以 Ｍｓｐ Ｉ限制性内切酶酶切扩增产物，酶切位点为 ＣＣＧＧ，３ｐ２４ＥＡＢＭＤ酶切片段为２１０／１２３＋８７ ｂｐ， 并以２％琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物。若正常组 织的电泳结果出现３个条带判定为信息个体，若酶 切后出现２个条带或１个条带判定为非信息个体。 对信息个体的相应肿瘤组织用同一方法进行ＰｃＲ 扩增产物经酶切及电泳检查，出现２条带或１条带 判定为杂合缺失。 ２．２．３ 杂合缺失标本的基因克隆和测序 采用ＴＡ 克隆法将存在杂合缺失的配对标本（包括正常组 织及肿瘤组织）等位基因的ＰｃＲ产物分别与ｐｕｃ— Ｔ载体连接，然后转化感受态细菌（大肠埃希菌）， 当转化率超过６０％，经蓝白斑筛选阳性克隆体， 提取质粒，以３ｐ２４ＥＡＢＭＤ位点特异性引物扩增出 约２ｌ０ ｂｐ大小的片段，证明在大肠杆菌的质粒中 含有目的基因片段。选取３对正常组织可被酶切、 肿瘤组织不可被酶切的阳性克隆配对标本（可酶 切组），以及３对正常组织不可被酶切、肿瘤组织 可被酶切的阳性克隆配对标本（不可被酶切组） 进行测序。测序委托上海生工生物工程技术服务有 限公司完成。 ３ 结 果 ｌ００对标本中，发现正常组织有信息个体４４ 份，其相应肿瘤组织出现杂合缺失２３份，杂合缺 ２２５ 失率为５２％。 选取３对正常组织含有能被限制性内切酶酶切 与３对正常组织含有不能被限制性内切酶酶切基因 片段的杂合缺失阳性克隆标本进行测序，发现在限 制性内切酶的ＭＤ位点上发生点突变。与正常组织 对照，可酶切组的３份肿瘤组织中，２份克隆１２３ 位碱基Ｇ—Ｃ，１份克隆１２４位碱基Ｔ—Ｃ；不可被 酶切组的３份肿瘤组织中，２份克隆Ｊ２４位碱基Ｇ —ｃ，１份克隆ｌ２２位碱基ｃ—Ｇ，详见表ｌ。 表ｌ 杂合缺失的阳性克隆标本限制性 内切酶ＭＤ位点的变异 ４讨论 一般认为，恶性肿瘤的形成是一个由多种癌基 因、抑癌基因共同参与的多步骤、多阶段的复杂变 化过程。其中，抑癌基因具有与癌基因相拮抗的功 能，可以保持染色体稳定，促进负向调控细胞生 长、增殖及分化的功能，从而抑制肿瘤的形成。与 此同时，等位基因杂合缺失的研究已经成为寻求新 的抑癌基因和探求已知抑癌基因致癌机制的热点， 利用这种技术，大量新的候选抑癌基因已经被定位 于不同的染色体上，并且已有一些基因被定位克隆 和鉴定。 目前国内外报道显示，３ｐ２４染色体位点在乳 腺癌、头颈部癌及肺癌的发病过程中发生高频率的 改变 。ｃｏｏｎ等 发现，６７％的口腔鳞癌组织存 在３ｐ２４．３区域杂合缺失现象；Ｋａｙａｈａｒａ等（２００１ 年）报道在口腔鳞癌３ｐ２４．２区域的杂合缺失率为 ６１％；Ｒｅｄ０ｎ等（２ｏ０１年）发现在分化程度较高 但不伴有淋巴结或远处转移的头颈鳞癌患者中， ３ｐ２４位点的杂合缺失率高达７３％；而Ａｆａｉ（２Ｏ０１ 年）等报道在舌鳞癌此位点的杂合缺失率则只有 ４４％。本研究应用ＰｃＲ—ＲＦＬＰ检测ｌ００份口腔鳞痛 标本３ｐ２４ＥＡｐＭＤ位点的杂合缺失情况，杂合缺失 率为５２％（２３／４４），与国外口腔鳞癌此位点杂合 缺失率的相关研究结果不尽相同，原因可能与各项 研究中患者来源的种族、地区及研究所采用的检测 技术不同有关。本研究提示口腔鳞癌患者３ｐ２４位 新医学２０ｏ９年４月第４Ｏ卷第４期 点半数以上存在杂合缺失，表明此位点杂合缺失与 口腔鳞癌的发生有密切关系，考虑此位点或其附近 可能有与口腔鳞癌相关的抑癌基因存在 抑癌基因在口腔鳞癌中最为常见的变化形式是 ［参考文献］ ［１ 赵琪，余东升．ＶＭ方案新辅助化学治疗在治疗口腔 鳞状细胞癌中的意义［Ｊ］．新医学，２０ｏ６，３７（１１）： ７２９ ７３Ｏ． 点突变。本研究为获得３ｐ２４ＥＡＢＭＤ位点杂合缺失 片段的具体信息，对目的基因片段进行了ＰＣＲ产 ［２： ｓｕＢＡＰＲＩＹＡ Ｒ，ＴＨＡＮＧＡＶＥＬＵ Ａ，ＭＡＴＨＡＶＡＮ Ｂ，ｅｔ ａＩ． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆ０ｒ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍ０ｕｓ ｃｅＵ ｃａｒ． ｃｉｎ０ｍａ ｉｎ Ｃｈｉｄａｍｂａｒａｍ，Ｓｏｕｔｈｅｍ Ｉｎｄｉａ： ａ ｃａｓｅ・ｃ０ｍｒ０ｌ 物的序列测定，用基因克隆技术将２条等位基因分 别进行克隆测序，避免了直接用ＰＣＲ产物测序所 ｓｔｕｄｙ［Ｊ ．Ｅｕｒ Ｊ ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ，２００７，１６（３）：２５ｌ一 ２５６． 造成的不可靠性及杂合子测序时的因难。本研究挑 选３对阳性克隆标本进行测序，结果发现在限制性 内切酶的识别位点上发生点突变，提示 ３ｐ２４ＥＡＢＭＤ位点在口腔鳞癌中的变化形式为点突 变。染色体畸变可导致了这些抑癌基因功能的丧 失，从而使组织有癌变的倾向。由于本文仅选用了 １个基因位点来检测杂合缺失，对确定可能存在的 抑癌基因的作用是很有限的，在今后的研究中应选 ［３］ ＢＲＡＡＫＨＵＩｓ Ｂ Ｊ，ＢＲＡＫＥＮＨ０ＦＦ Ｒ Ｈ，ＬＥＥＭＡＮＳ Ｃ Ｒ． Ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏ｝ｒｅｎｅｓｉｓ ［Ｊ］．Ａｎｎ ０ｎｃｏｌ，２０ｏ５，１６（Ｓｕｐｐ１ ２）：ｉｉ２４９－ｉｉ２５Ｏ． ［４ 李涛，吴明拜，赵学信，等．食管癌３ｐ２４等位基因 Ｌ０Ｈ及其扩增产物克隆的研究［Ｊ］．新疆医科大学学 报，２ｏ０３，２６（３）：２２４—２２６． ［５ｊ Ｃ００Ｎ Ｓ Ｗ，ＳＡＶＥＲＡ Ａ Ｔ，ｚＡＲＢ０ Ｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｒ０ｇ— ｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｍｚｙｇ０ｓｉｔｙ ａｔ ８ｐ２ｌ ａｎｄ ９ｐ２１ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１１１（２）：２０６—２ｌ２． 用更多的标记基因或采用大规模基因组扫描，才能 为确定是否存在潜在的抑癌基因提供更有效和直接 的证据 （收稿日期：２０ｏ９—０ｌ—Ｏ８） （编辑：林燕薇） 散发性戊型病毒性肝炎ｌ１０例流行病学与临床特点分析 暨南大学附属第一医院感染科（５ｌ０６３０） 黄思敏陈友鹏唐永煌 ［摘要】 目的：探讨散发性戊型病毒性肝炎（戊肝）的流行病学特征及临床特点。 方法：回顾性分析１ｌ０例散发性戊肝患者的病历资料。结果：散发性戊肝全年四季均可发病， 无家庭聚集现象。患者以男性为主，男女比例为３．６：１；非老年组（６０岁以下）８１例（占 ７３．６％），老年组（等于或大于６０岁）２９例（占２６．４％）。单纯戊肝（单纯感染）７ｌ例，戊 肝重叠慢性肝病（重叠感染）３９例，其中以重叠乙型病毒性肝炎居多。重叠感染者的重型肝 炎发生率（１８％）明显高于单纯感染者（４％）？起病初期有发热、鼻塞、咽痛等症状。黄疸 多见，占７８．２％，其次为食欲减退及恶心等消化道症状。戊肝重叠肝炎后肝硬化者的ＡＬＴ、 ＡｓＴ比单纯感染者明显降低（均为Ｐ＜０．０１）？老年组患者的总胆红素比非老年组明显升高 （Ｐ＜０．Ｏ５）。全组并发症发生率为２８．２％（３ｌ／１１０），其中老年组的并发症发生率明显高于非 老年组（Ｐ＜０．０１），重叠感染者的并发症发生率亦高于单纯感染者（Ｐ＜Ｏ．０１）。经护肝、退 黄、对症等治疗，治愈４１例，好转６６例，死亡１例，自动出院２例。结论：散发性戊肝全年 均可发病，患者以中青年男性居多，大多数患者预后良好，但老年及重叠感染患者的并发症发 生率较高，肝功能损害较严重。 ［关键词］ 戊型病毒性肝炎，散发性 重叠感染 病毒性肝炎 流行病学 临床分型 ｌ 引 言 戊型病毒性肝炎（戊肝）是由戊型肝炎病毒 感染引起的急性传染病，常以流行性或散发性方式 在人群中传播…。散发性戊肝占散发性急性病毒 性肝炎的８．６％，且患病率有逐年增加的趋势 引。 为进一步了解本地区散发性戊肝的流行病学特征和 临床特点．我们对我院收治的１１０例戊肝患者的临 床资料进行回顾性分析，现将结果报道如下。