反应时间对DPPH・法、ABTS+・法评价
抗氧化性结果的影响
林恋竹，赵谋明*
(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)
摘 要：由于DPPH・法、ABTS+・法操作简单，不需要特殊的检测设备(通过反应体系颜色的改变评价试样抗氧化性)，因此，常被选作抗氧化性能评价方法。用这两种方法进行抗氧化性评价时，通常用固定反应时间下算得的EC50值(自由基清除率为50%时所需试样浓度)表征抗氧化剂的抗氧化性强弱(对于DPPH・法，固定时间为30min；对于ABTS+・法，固定时间为6min)，结果表明：不同抗氧化剂因其组成、结构的差异，与DPPH・、ABTS+・反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。
关键词：反应时间；DPPH・法；ABTS+・法；抗氧化性评价
Effect of Reaction Time on DPPH and ABTS+ Radical Scavenging Assays for Antioxidant Capacity Evaluation
LIN Lian-zhu，ZHAO Mou-ming*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract ：Due to the operation simplicity of DPPH and ABTS+ radical scavenging arrays for evaluating antioxidant capacityand without a need for specific equipments, both assays have been widely chosen to evaluate antioxidant capacity. EC50 is generallyused as a representative parameter for antioxidant capacity of antioxidants determined using DPPH・ assay at 30 min of fixedreaction time or using ABTS+・ assay at 6 min of fixed reaction time. The results of this investigation indicated that a big differencewas made by the compositions and structures of antioxidants to reaction rates with DPPH・and ABTS+・free radicals. Thereaction equilibrium time was also different so that wrong estimations might be achieved at the condition of fixed reaction time.Key words：reaction time；DPPH radical scavenging array；ABTS+ radical scavenging array；antioxidant capacityevaluation
中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)05-0063-05
抗氧化剂能使自由基失活主要基于两种机制：氢质子转移(HAT)和电子转移(ET)。在给定体系中，ET与HAT可以同时发生，主反应机制由抗氧化剂的结构、性质、溶解性、分配系数、溶剂系统决定。HAT通常快速，在分秒内就能完成；ET通常较慢，完成反应需要较长时间[1]。
由于DPPH・法、ABTS+・法操作简单，不需要特殊的检测设备，通过反应体系颜色的改变评价试样抗氧化性，许多实验室将ABTS+・法和DPPH・法用作抗氧化剂的抗氧化能力评价方法。Du等[2]评价了猕猴桃
收稿日期：2009-06-25
基金项目：广东省科技计划项目(2007A020902002)
果实抗氧化性以及多酚，VC含量与抗氧化性的关系；Liu等[3]评价了荔枝花不同溶剂提取物的抗氧化性；Shyu等[4]评价了莳萝花乙醇提取物的抗氧化性；Dudonne等[5]评价了30种植物种子、花、叶、果实、根提取物的抗氧化性；Seeram等[6]评价了美国富含多酚饮料的抗氧化性；Zhou等[7]评价了杨梅渣的抗氧化性；Liu等[8]评价了苦丁茶的抗氧化性；Zhang等[9]评价了土茯苓提取物的抗氧化性；Su等[10]评价了黑胡椒、肉豆蔻、玫瑰果、肉桂和牛至叶的抗氧化性；Cristina等[11]评价了高蛋白质羽扇豆产品的抗氧化性。ABTS+・由强氧化剂与
作者简介：林恋竹(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：linlinlin137@sina.com*通信作者：赵谋明(1964—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：femmzhao@scut.edu.cn64 2010, Vol. 31, No. 05
食品科学酸、芦丁、抗坏血酸均为分析纯。1.2
※基础研究
ABTS盐反应产生，DPPH・则是一类较稳定的自由基[12]。ABTS+・的氧化还原电势为0.68V[13]，只要某化合物的氧化还原电势低于0.68V，就能将ABTS+・还原，导致体系绿色减退。同时，ABTS+・又是一类自由基，也可以通过HAT机制导致体系绿色减退。DPPH・也并非是纯粹的ET反应，在反应体系中，也会伴随HAT机制。即是说DPPH・法紫色减退可能是ET机制、HAT机制，或是两者共同作用的结果。决定反应的主要因素是空间位阻效应，空间位阻大的抗氧化剂与DPPH・较难反应，反应机制可能与空间位阻小的抗氧化剂不同，反应达到平衡的时间也较长[1]。通常，氧化还原反应在4～6min内就能完成。但对于典型的ET反应，例如FRAP法，Pulido等[14]研究了槲皮素、单宁酸、白藜芦醇、芦丁、邻苯二酚与Fe3+-TPTZ的反应，体系吸光度随反应时间的变化，发现：反应在4min内并未完成，反应时间定在4min与反应时间定在30min得到的各抗氧化剂的EC50值排序存在差异，且反应时间定在30min得到的各抗氧化剂的EC50值比反应时间定在4min得到的各抗氧化剂的EC50值低。Antonio等[15]在使用DPPH・法评价6种类胡萝卜素清除自由基能力大小，采用抗自由基效率(AE)表征抗氧化剂清除DPPH・能力。AE=(1/EC50)tEC50，其中，tEC50表示在EC50浓度下，反应达到平衡所需时间。实验结果表明：尽管反应条件一致，6种类胡萝卜素的结构也很相似，但由于这6种类胡萝卜素结构上细微差别，tEC50从12 min到29 min不等。因此，如若在不了解抗氧化剂与ABTS+・或DPPH・反应的动力学机制的情况下，就简单将反应控制在某一时间下，并在相同条件下，与其他抗氧化剂的EC50值比较，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。本实验研究BHA、BHT、TBHQ、抗坏血酸棕榈酸酯、VE油、D-异抗坏血酸钠、茶多酚、竹叶提取物、迷迭香提取物、单宁酸、芦丁和抗坏血酸与ABTS+・反应及与DPPH・反应时，反应时间对ABTS+・和DPPH・清除率的影响，旨在为ABTS+・法和DPPH・法评价抗氧化剂的抗氧化性提供参考。１1.1
材料与方法材料与试剂
仪器与设备
752N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有方法样液制备
限公司；微型旋涡混合仪 沪西分析仪器厂。1.31.3.1
根据各种抗氧化剂溶解特性差异，采用不同溶剂配制样品储备液。称取一定质量的BHA、BHT、TBHQ、抗坏血酸棕榈酸酯、VE油、芦丁，分别用无水乙醇溶解并定容至10mL；称取一定质量的D-异抗坏血酸钠、茶多酚、单宁酸、抗坏血酸，用蒸馏水溶解并定容至10mL；称取一定质量的竹叶提取物、迷迭香提取物用60%乙醇溶解并定容至10mL，制成样品储备液。测定时，用蒸馏水稀释至所需浓度，制成待测液。1.3.2
抗氧化性的评价
1.3.2.1DPPH・清除能力测定
参考Luo等[16]的方法，并作适当修改。吸取样品待测液2.0mL，加入0.2mmol/L DPPH・溶液2.0mL，摇匀，放置一定时间。以无水乙醇调零，测定517nm波长处的吸光度(A样品)。测定样品待测液2.0mL与无水乙醇2.0mL混合液在517nm处的吸光度(A对照)，再测定2.0mLDPPH・溶液与2.0mL无水乙醇在517nm波长处的吸光度(A空白)。DPPH・清除率按以下公式计算。
A样品－A对照
DPPH・清除率/%＝(1－——————)×100
A空白
1.3.2.2
ABTS+・清除能力测定
参考Re等[17]的方法，并作适当修改。配制ABTS+・储备液：配制2.45mmol/L过硫酸钾，用过硫酸钾溶解ABTS，配成7mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置12～16h，这种储备液可稳定3～4d。配制ABTS+・测定液：将ABTS+・储备液以磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH 7.4)稀释，使其吸光度在734nm波长处达到0.700±0.020。测定：取4mLABTS+・测定液，加入40μL样品待测液，准确振荡30s，测定反应一定时间后734nm波长处的吸光度。
A样品
+
ABTS・清除率/%＝(1－———)×100
0.700
２2.1
结果与分析
反应时间对DPPH・清除能力的影响
BHA、BHT、TBHQ、抗坏血酸棕榈酸酯、VE油(VE含量≥50%)、D-异抗坏血酸钠、茶多酚(纯度≥95%)、竹叶提取物(黄酮含量≥30%)、迷迭香提取物(鼠尾草酸含量≥30%)均为食品级抗氧化剂，由东莞市中堂广益食品添加剂实业有限公司提供；DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、ABTS(2,2＇-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、过硫酸钾、单宁
根据本实验室测得的不同试样EC50值，将试样分为
两组，一组为：单宁酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗坏血酸、芦丁、BHT、D-异抗坏血酸钠；另一组
※基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 0565
为抗坏血酸棕榈酸酯、迷迭香提取物、竹叶提取物、VE油。前一组试样配制成10μg/mL；后一组试样配制成30μg/mL。分别测定不同反应时间下，试样清除DPPH・的能力。每个点平行操作3次，取平均值。2.1.1
1009080706050403020100
0
6
121824303642485460
时间/min
图１ 化学反应时间对第一组试样清除DPPH・能力的影响Fig.1 Effect of chemical reaction time on antioxidant capacityevaluation of samples from the first group using DPPH・ assayDPPH・清除率/%DPPH・清除能力随时间变化不大，而迷迭香提取物与竹叶提取物的DPPH・清除能力随时间有较明显的变化。说明抗坏血酸棕榈酸酯，VE油与DPPH・反应速率快，而迷迭香提取物与竹叶提取物与DPPH・反应速率较慢。
因此，单用一个固定时间下的DPPH・清除率(EC50)表征试样的抗氧化性是不准确的。因为试样的结构不一样，与DPPH・反应机制可能不一样。DPPH・可以既通过电子转移消除也可通过氢质子转移清除，究竟是电子转移消除DPPH・多过通过氢质子转移清除DPPH・，抑或相反，与试样的组成，结构相关。因此，反应平衡点不一样，有的反应能在30min内完成，而有的反应却需要较长时间。
DPPH・法评定试样抗氧化性时，当反应时间延长到60min时，虽某些试样与DPPH・反应还在继续，但清除率的增幅不大，某些与DPPH・反应已经趋于稳定，但试样DPPH・清除能力排序情况已经趋于稳定。2.2
反应时间对ABTS+・清除能力的影响
根据本实验室测得的不同试样EC50值，将试样分为两组，一组为：单宁酸、茶多酚、TBHQ、BHA、抗坏血酸、芦丁、BHT、D-异抗坏血酸钠；另一组为抗坏血酸棕榈酸酯、迷迭香提取物、竹叶提取物、VE油。前一组试样配制成100μg/mL；后一组试样配制成600μg/mL。分别测定不同反应时间下，试样清除ABTS+・的能力。每个点平行操作3次，取平均值。2.2.1
80ABTS+・清除率/%7060504030200
6
121824303642485460
时间/min
第一组试样对DPPH・清除能力随时间变化
单宁酸茶多酚TBHQBHA抗坏血酸芦丁
D-异抗坏血酸钠BHT
由图1可看出，TBHQ、抗坏血酸、D-异抗坏血酸钠随着时间延长，清除率并无增加，可见，这3种试样与DPPH・的反应速率很快，很快达到平衡。而单宁酸、茶多酚、BHA、芦丁、BHT 这5种试样随着时间延长，清除率有明显的增加，说明，这5种试样与DPPH・的反应速率不是很快，需要较长时间才能达到平衡。
另外，在反应初期(6min时)，各试样DPPH・清除能力按如下强弱顺序排列：单宁酸＞茶多酚＞TBHQ＞BHA＞抗坏血酸＞芦丁＞D-异抗坏血酸钠＞BHT；而在反应时间为18min时，各试样DPPH・清除能力的强弱顺序发生改变：单宁酸＞茶多酚＞ TBHQ≈BHA＞芦丁＞抗坏血酸＞BHT＞D-异抗坏血酸钠；反应时间为36min时，BHT的DPPH・清除能力接近抗坏血酸的DPPH・清除能力；在反应时间为42min时，BHT的DPPH・清除能力超过抗坏血酸的DPPH・清除能力。2.1.2
60DPPH・清除率/%504030201000
6
121824303642485460
时间/min
图２ 化学反应时间对第二组试样清除DPPH・能力的影响Fig.2 Effect of chemical reaction time on antioxidant capacityevaluation of samples from the second group using DPPH・ assay
第一组试样对ABTS+・清除能力随时间变化
单宁酸茶多酚芦丁BHA抗坏血酸TBHQBHT
D-异抗坏血酸钠
第二组试样对DPPH・清除能力随时间变化
抗坏血酸棕榈酸酯迷迭香提取物竹叶提取物VE油图３ 化学反应时间对第一组试样清除ABTS+・能力的影响Fig.3 Effect of chemical reaction time on antioxidant capacityevaluation of samples from the first group using ABTS+・ assay
由图3可看出，BHA、抗坏血酸、TBHQ、D-异抗坏血酸钠ABTS+・清除能力随反应时间延长影响不大，可见，这4种试样与ABTS+・的反应速率很快，很快达到平衡。而单宁酸、茶多酚、芦丁、BHT的ABTS+・清除能力随时间有较明显的改变，说明，这4种试样与ABTS+・的反应速率不是很快，需要较长时间才能达到平衡。
另外，在反应初期(6min时)，各试样ABTS+・清
由图2可看出，抗坏血酸棕榈酸酯与VE油的
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食品科学※基础研究
除能力按如下强弱顺序排列：单宁酸＞茶多酚＞芦丁＞BHA＞抗坏血酸≈TBHQ≈BHT＞D-异抗坏血酸钠；而在反应时间为12min时，BHT的ABTS+・清除能力超过了BHA、抗坏血酸、TBHQ。2.2.2
9080706050403020
时间下的DPPH・清除率(EC50)表征试样的抗氧化性是不太准确的。对于单用一个固定时间下的ABTS+・清除率(EC50)表征试样的抗氧化性也是不太准确的。3.2
应该准确明了待测试样与DPPH・和ABTS+・反应机制，至少应测定一定浓度下该物质DPPH・和ABTS+・清除能力随时间变化，确定化学平衡点，以此确定反应时间，并且，在与其他标准物做比较前，也应测定相同浓度下标准物DPPH・和ABTS+・清除能力随时间变化，确定化学平衡点，以此确定反应时间，综合考虑反应时间，才能比较试样与标准物的抗氧化性。也可以通过延长反应时间，例如固定反应时间为
第二组试样对ABTS+・清除能力随时间变化影响
ABTS+・清除率/%抗坏血酸棕榈酸酯迷迭香提取物竹叶提取物VE油0 6 12 18 24 30 36 4248 5460
时间/min
60min，大多数化合物能与DPPH・、ABTS+・充分反应，可减小评价误差。但也不排除个别抗氧化剂(特别是天然提取物)需要更长时间达到反应平衡，甚至反应动力学曲线出现多个拐点，给抗氧化性评定结果造成误差。
参考文献：
图４ 化学反应时间对第二组试样清除ＡＢＴＳ＋・能力的影响Fig.4 Effect of chemical reaction time on antioxidant capacityevaluation of samples from the second group using ABTS+・ assay
由图4可看出，VE油的ABTS+・清除能力随时间变化不大，可见，其与ABTS+・的反应速率很快，很快达到平衡。而竹叶提取物、迷迭香提取物、抗坏血酸棕榈酸酯这3种试样的ABTS+・清除能力随时间有较明显的改变，说明，这3种试样与ABTS+・的反应速率不是很快，需要较长时间才能达到平衡。
另外，在反应初期(6min时)，各试样ABTS+・清除能力按如下强弱顺序排列：抗坏血酸棕榈酸酯＞竹叶提取物＞迷迭香提取物＞VE油；而当反应时间为24min时，竹叶提取物的ABTS+・清除能力超过抗坏血酸棕榈酸酯。
因此，单用一个固定时间下的ABTS+・清除率(EC50)表征试样的抗氧化性是不太准确的。因为试样的结构不一样，与ABTS+・反应机制可能不一样。ABTS+・可以既通过电子转移消除也可通过氢质子转移清除，究竟是电子转移消除ABTS+・多过通过氢质子转移清除ABTS+・，抑或相反，与试样的组成，结构相关。因此，反应平衡点不一样，有的反应能在6min内完成，而有的反应却需要较长时间。
ABTS+・法评定试样抗氧化性时，当反应时间延长到60min时，虽试样与ABTS+・反应还在继续(某些试样ABTS+・清除率增幅较大，而某些试样ABTS+・清除率增幅较小)，但试样ABTS+・清除能力排序情况已经趋于稳定。这可能与ABTS+・不是一种稳定的自由基有关，即便反应结束，剩余的ABTS+・由于不稳定，颜色消退，因此，试样ABTS+・清除率随时间有不同程度的增加。３3.1
结 论
对于DPPH・清除能力评价来说，单用一个固定
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