蛋白酶和蛋白酶抑制剂在动物

黑腹果蝇精液蛋白酶Seminase对蛋白水解和再交配繁殖过程的调控

摘要：蛋白酶和蛋白酶抑制剂在动物（从无脊椎动物到哺乳动物）精液中确定，并且在黑腹果蝇精液蛋白模块（SFPs）中形成一种主要的蛋白种类。哺乳动物中除了单一的调控精液液化凝块的蛋白酶级联，在精液中还未发现蛋白水解级联。在黑腹果蝇中，在交配过程中SFPs同精液一起被转移到雌性体内，这些是引起雌性交配后反应的必要条件。尽管SFPs会在交配过程中或交配完成后被水解，但是，事实上，关于参与了女性的精液裂解或蛋白水解活性的生理结果的蛋白酶还有待探究。本篇文章展示了黑腹果蝇交配期间或交配后精液中蛋白酶级联反应的证据。利用RNAi干扰SFP CG10586的表达，我们证明了它作用于SFP CG11864基因的上游，并且参与排卵和精子进入存储过程。这些结果指出蛋白质水解在昆虫SFPs的重要作用，表明蛋白酶级联是一种针对雌性多次再交配反应调控机制。

关键词：黑腹果蝇；交配；半酶；蛋白质级联；调控

The Drosophila melanogaster Seminal Fluid Protease “Seminase” Regulates Proteolytic and Post-Mating Reproductive Processes

Abstract: Proteases and protease inhibitors have been identified in the ejaculates of animal taxa ranging from invertebrates to mammals and form a major protein class among Drosophila melanogaster seminal fluid proteins (SFPs). Other than a single protease cascade in mammals that regulates seminal clot liquefaction, no proteolytic cascades have been identified in seminal fluids. In Drosophila, SFPs are transferred to females during mating and, together with sperm, are necessary for the many post-mating responses elicited in females.

Though several SFPs are proteolytically cleaved either during or after mating, virtually nothing is known about the proteases involved in these cleavage events or the physiological consequences of proteolytic activity in the seminal fluid on the female. Here, we present evidence that a protease cascade acts in the seminal fluid of Drosophila during and after mating. Using RNAi to knock down expression of the SFP CG10586, a predicted serine protease, we show that it acts upstream of the SFP CG1186to process SFPs involved in ovulation and sperm entry into storage. These results point to an important role for proteolysis among insect SFPs and suggest that protease cascades may be a mechanism for precisetemporal regulation of multiple post-mating responses in females

Key Words: Drosophila melanogaster, mating, seminase, protease cascade, Regulate

前言

蛋白质水解调节器是动物类精液的组成成分，这些精液蛋白酶作用机制对已交配雌性的影响还有待探索。由于大多数蛋白酶被合成为钝化酶，并且要求除去短的N末端序列以致活。精液凝结是许多动物交配后的反映的重要特征。蛋白酶可以破坏，激活或以其他方式调节其它蛋白质的功能。在精液中，许多蛋白质具有交配之后被激活或降解;蛋白水解为做到这一点，因为精液中的蛋白质在细胞，其中大多数其他监管程序不能使用之外采取行动的有效途径。尽管存在于许多动物的精液，几乎没有什么人知道该种它们调节过程蛋白酶。在这里，我们提出了一个蛋白酶级联反应的证据。这种级联涉及被交配过程中被激活两种蛋白酶。一旦在雌性中下游蛋白酶作用于另外两个蛋白质，是对排卵和精子储存重要。有趣的是，蛋白酶的级联CG10586的顶部，也需要其它再交配反应，包括产卵和精子的

使用，独立的第二蛋白酶。因此， CG10586一般会被用来调控雄性的快速再交配。

1.实验方法

（1）试虫

试虫选用Canton-S品系3-6日龄未交配雌虫与3-6日龄未交配雄虫在含有滤纸浸湿方形玻璃瓶中交配。交配进行观察，并记录交配开始时间。交配时间较短的（低于15分钟）则被丢弃。交配后的雌性立即置于超低温冰箱中速冻并解剖。

（2）方法

样品制备和Western blot分析。本研究样本的制备使用5-15％梯度SDS/ PAGE分离雌性生殖道的样品（RT）是从4-6交配雌性下生殖道中提取。样品相同的那些用于蛋白质印迹，制备和蛋白浓度测量相对于BSA标准，按照制造商的指导方针。精子数量统计。精子数量统计时间为交配开始后2h，4d和10d。用于SR的数据是两个计数的平均值。精囊中精子数量数据是两个平均值（每个精囊）的总和，最后使用双尾Student t-检验对数据进行分析

2. 实验结果

（1）Ovulin and Acp36DE中常规CG11864的调节过程需要SeminaseCG11864导肽分裂需要Seminase

我们测试了5种预测蛋白酶精液蛋白来确定CG11864潜在影响蛋白。这些测试精液蛋白的预测，包括CG10586，CG10587, CG4815, CG12558和CG32382。卵巢内泌素

产生只需要这几种当中的Seminase，并且CG10587不参与卵巢内泌素产生。Western blotting确定通过RNA干扰半酶至少减少98%的表达量，转录水平也降低。雌性与Seminase受RNA干扰的雄性交配产生CG11864蛋白，可观察到全长分子量，但其切割部分始终未观察到，与对照雄性交配全场和片段均可观察到。因此可以说明交配过程中CG11864导肽切割需要Seminase。

（2）CG11864-独立再交配过程需要Seminase

与Seminase沉默的雄性交配后，雌性产卵量连续10天都显著低于对照组；与CG4815沉默的雄性交配后产卵总量无差异。根据Figure 3C和3D对比发现，与受干扰的雄性交配后的产卵量减幅大于未受干扰的，与是否干扰CG4815的雄虫交配，雌虫产卵量减幅基本一致。结果表明在交配后第一天，Seminase对产卵量有重要影响。

（3）精子释放需要Seminase

黑腹果蝇中，精子主要储存在储精囊和受精囊中，但大部份储存在储精囊中。为了验证半酶是否会影响精子释放，我们令雌性与Seminase基因沉默后的雄性交配来验证精子是否释放。结果表明，与沉默的雄性交配后储精囊张残存的精子远远多于对照组，这是因为基因沉默后，精子无法释放造成的，因此，精子释放需要Seminase。

3. 讨论

Seminase/CG11864通路的作用。尽管排卵激素被延迟释放，交配后24h产卵量均受到影响，但排卵激素基因被完全沉默后对排卵量影响很小。此外，全长排卵激素的异位表达足以诱导雌性排卵，这就表明排卵激素处理后附加效果可能太小，也有可能是，当

Seminase被干扰到非常低的水平任然对其产卵有影响。文章中尚未观察到Seminase沉默后精子进入存储器官，也未观察到Acp36DE。相反，缺陷在以后的时间点被认为在从存储精子释放，这是不符合Acp36DE排除相关联的表型。Acp36DE处理针对该蛋白的其他功能是重要的。例如，Acp36DE是基因定位的组成部分，但它的定位匹配功能仍是未知的。需要进一步研究。

参考文献（References）

Brooke A. LaFlamme, K. Ravi Ram, Mariana F. Wolfner. 2012. The Drosophila melanogaster seminal fluid protease “Seminase” regulates proteolytic and

post-mating reproductive processes. PLoS genetics, 8(1):1-11