一：实验目的：
1. 掌握固体优良菌种制作的工艺流程 2. 熟练消毒灭菌技术和接种技术。 二、基本原理
一般菌种培养工艺过程按照培养基物理性状不同，将菌种培养方式分为两大类：固体菌种和液体发酵。固体菌种来讲，是指以气相作为连续相，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养的一种或多种微生物（图）。
固体底物基质固态发酵利用的培养基是既充当固相，又为微生物生长提供营养的初级农作物产物，如麸皮、马铃薯、谷子、豆饼以及其他含淀粉和纤维素的农作物产品。第二种固态发酵采用的固体是惰性载体，这些载体可以是天然的，也可以是人工分成的。这些载体材料有大麻、珍珠岩、聚氨酯泡沫体、蔗糖渣和聚苯乙烯等。
固体底物与一定比例的水充分混匀，装入三角瓶，灭菌，冷却至室温，接种在一定的温度下培养制得。 三、实验材料
1.菌种：灵芝（Ganoderma applanatum）。
2.材料：麸皮。
3.其他：250mL三角瓶、量筒、聚丙烯塑料袋、线绳、剪刀等。 四、培养基配方 麸皮：水＝3：4 五、菌种制作 1.拌料
称量一定重量的麸皮，加适量水拌匀。 2.装瓶
将35g培养基装入250mL三角瓶内，擦净瓶口处的培养基，塞上梅塞，用两层报纸封口，用尼龙绳扎紧。 3.灭菌
将装有培养基的三角瓶置灭菌锅内，121℃灭菌1h，注意压力表和温度表的变化。灭菌结束后，缓慢放气，待瓶冷至80℃左右，将其搬入超净工作台内。 4.接种
（1）菌种表面消毒； （2）将菌种斜面分成5等份；
（3）将菌种接到培养基的顶部中心处； （4）1支试管种可接固体培养基5瓶左右。 5.培养
接种后，置28℃生化培养箱恒温培养，其中在第3～5天摇匀一次，大约7天左右，菌丝长满全瓶。 6.观察
接种3d后，开始对原菌种生长情况进行观察，每天观察一次。 （1）记录菌丝萌发、生长、颜色；
（2）观察菌种是否被污染，被哪种微生物污染； （3）记录菌丝满瓶天数。 六、实验思考
1.固体真菌与试管斜面接种有什么不同？
答：固体真菌接种有孢子的接孢子，没有孢子的就接菌丝，甚至挖一块到新的斜面上即可，菌丝可以蔓延至整个斜面。但是有的丝状真菌菌丝延伸很慢，这个时候要尽量接满整个斜面。如果要将固体培养的丝状真菌接种到液体培养基里，直接挑取菌丝体到液体培养基中即可
对于细菌来说，试管斜面接种需要划线。
2.如何辨别食用真菌被细菌、霉菌污染？
答：霉菌的菌丝和菌落外观与食用菌菌丝显著不同，霉菌产生的孢子具特殊的颜色，因此
可以肉眼鉴别。无污染的菌种外观洁白、均匀、边缘整齐；污染过的菌种与原菌种明显不同，必要时按照菌丝生长状态检验方法制作水封片，显微镜下观察。
在PDA固体培养基上，糊状的细菌菌落可以很明显的与食用菌菌落相区别；在液体培养基中，培养产生的大量细菌会均匀分布在培养基中，使培养基由半透明变浑浊，培养液浑浊的即表示有细菌污染。
3.使用超净工作台接种时，怎样确保菌种既不被污染也不被烫死？
答：在距酒精灯外焰10CM以内范围内进行接种的相关操作，可防止染菌。为避免被烫死，可稍离外焰远一点，但需在10CM无菌范围内。
4.固体菌种接种和试管斜面菌种接种有何异同？
答：固体真菌接种有孢子的接孢子，没有孢子的就接菌丝，甚至挖一块到新的斜面上即可，菌丝可以蔓延至整个斜面。但是有的丝状真菌菌丝延伸很慢，这个时候要尽量接满整个斜面。如果要将固体培养的丝状真菌接种到液体培养基里，直接挑取菌丝体到液体培养基中即可
对于细菌来说，试管斜面接种需要划线。
5.如何鉴定固体菌种的质量？
答：⑴菌种的真实性检测：即菌种名称与其栽培性状是否一致。菌种的真实性检测常从生理、生化和分子生物学检测三个方面进行。
①生理检测：拮抗检测，拮抗是指具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线性边缘的现象。检测结果出现两菌株菌落交界处菌丝隆起，气生菌丝密集或稍隆起，两隆起之间培养基清晰可见，外观似沟或两菌株菌落之间有一定宽度的培养基明显可见，即表明待检菌种与标准菌种是不同的菌株；如果没有表现出拮抗，待检菌种与标准菌种可能是同一菌株也可能不是，还不能做出明确的判断。因此可用生化和分子生物学检测作为检测菌种真实性的辅助方法。
②生化检测（酯酶同工酶电泳法）在生物中，酶的表达受遗传基因的调控，在凝胶电泳中经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩，在分子筛效应和电场效应作用下而发生分离。从食用菌菌丝体中提取的酶液经电泳后，进行酯酶的生物化学染色，不同的酯酶组分显示在凝胶的不同位置而形成酯酶同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其酯酶同工酶酶谱也相同。因此可以用酯酶同工酶酶谱对食用菌菌种的真实性进行鉴定。但是，由于酶液保藏的条件比较苛刻，4℃下保藏仅7天，所以增加了菌种质量检测工作的强度。
③分子生物学检测：随着分子生物学技术的进步，DNA指纹技术首先被引入真菌进
行属、种、变种、菌株等遗传多样性的研究，以后逐渐被引入食用菌品种的鉴定和鉴别。
⑵纯度的检测：纯度指菌种的纯化程度，不能混有病毒、细菌、霉菌、螨虫、线虫等。除了用肉眼观察判断外，根据染杂对象不同采用以下相应的检测方法。
①霉菌检测：危害食用菌菌种的霉菌生长，需要的营养和温度与食用菌相近，因此
采用食用菌通用的PDA培养基即可，无需使用霉菌专用培养基，另外霉菌的菌丝和菌落外
观与食用菌菌丝显著不同，霉菌产生的孢子具特殊的颜色，因此可以肉眼鉴别。无污染的菌种外观洁白、均匀、边缘整齐；污染过的菌种与原菌种明显不同，必要时按照菌丝生长状态检验方法制作水封片，显微镜下观察。
②细菌检测：危害食用菌菌种的细菌在食用菌菌种生长的营养和温度条件下可以很
好的生长。因此采用食用菌通用的PDA培养基或细菌营养肉汤培养基均可，在25℃-28℃下培养，而不采用细菌培养基的通用温度37℃。在PDA固体培养基上，糊状的细菌菌落可以很明显的与食用菌菌落相区别；在液体培养基中，培养产生的大量细菌会均匀分布在培养基中，使培养基由半透明变浑浊，培养液浑浊的即表示有细菌污染。
③螨虫和线虫检测：用接种针挑取少许待检菌种于载玻片上的水滴中，撕散菌丝，
盖上盖玻片，用10倍或40倍物镜观察，检查是否有螨虫或线虫存在。
⑶活力的检测：活力指菌种的生活适应能力和抗逆能力，它们反映菌种的活力主要包括菌丝外观、显微形态、萌发时间和长速、天然基质上生长速度、外观、耐高温和一致性等。经验认为菌种活力涉及栽培的产量和抗性，活力就自然成为菌种质量检测的重要内容。它主要包括菌落外观、显微形态、萌发和长速、天然基质上的生长速度、耐高温性和一致性六方面的检测。
①菌落外观：菌丝形状、色泽、生长速度、疏密、气生菌丝多寡、触感、菌皮有无、
有无分生孢子、厚垣孢子、有无色素分泌及其颜色等。
②显微形态：观察菌丝的粗细并对其进行测量、观察是否有锁状联合、观察锁状联
合的形态特征。每一检验应检查不少于50个视野，操作方法参考《食用菌生产与管理手册》。
③萌发和长速：培养皿直径90mm、培养基定量25ml（用试管定量分装灭菌后倾倒）、
接种物菌龄（5-8天，根据种类的特点自行确定）、接种块5mm（打孔器从菌落周围打出）、接种时注意菌丝面朝上、最适温度下暗陪养，温度允许浮动±1℃。萌发时间以对光肉眼可见萌发为标准。长速的计算以菌丝长到培养基上开始为长速起始计算时间，以菌落长至离5mm-10mm满平板时为止。
④天然基质上的生长速度：使用25mm直径试管、接种块10mm±2mm、菌丝朝
上，生产中以木屑为主料的种类使用杂木屑（细）78%、麦麸20%、糖1%、石膏1%配方，以棉籽壳为主料的种类可以纯棉籽壳为基质，含水量与生产相同，pH值自然。
⑤耐高温性：各种类的温度和时间的设定要结合生产实际中可能出现的高温温度决
定，多数种类可能在35℃以上。而非致死温度。高温检测前的基本培养基和方法与萌发和长速测定相同，在最适温度下培养至菌落20mm±2mm时置于设定的高温条件下测试。
⑥一致性检测：方法与萌发和长速测定相同。
⑷种性的检测：种性是指食用菌的品种特性，是鉴定食用菌菌种或品种优劣的重要
标准之一。一般包括形态特征、生物学特性和农艺性状。
①形态特征：包括菌丝形态、菌落特征、各种菌丝体变态及组织体形态，子实体发
生方式。对于丛生种类个体间及分枝的角度，菌盖的颜色、质地、长短及直径、有无鳞片
或绒毛，菌柄着生方式、菌柄与菌盖比。
②生物学特性：无论是菌丝生长阶段，还是子实体发生时期，一个栽培·品种在培
养基质、温度、湿度、水分、光照、酸碱度等方面都有其自身特有的要求。不同栽培品种之间通常会有所差异。在严格控制的条件下，记载各个栽培品种最适生长发育的生理条件。
③农艺性状：包括各级菌种的培养基配方、栽培料配方、栽培方式、主要管理措施、
出菇迟早、出菇潮数、栽培周期和产品品质等。这些主要是通过肉眼观察和记录来实现。
实验二 液体菌种的制作及使用方法
一、实验目的：
1. 掌握固体优良菌种制作的工艺流程 2. 进一步熟练消毒灭菌技术和接种技术。 二、基本原理：
液体菌种制作分为两种：液体深层培养和液体摇瓶培养。微生物深层培养时首先要进行摇瓶培养。液体药瓶培养主要是由于不断的摇动，瓶中的培养基不断与空气接触，因此气液交换没有气体分子在气泡中扩散和气液界面的阻力，有利于气体交换的迅速进行。将斜面试管或固体菌种接入已灭菌的三角瓶培养液中，置摇床上振荡培养，称为摇瓶培养。经摇瓶培养的真菌菌丝体一般呈球状 絮状等多种形态，培养液呈粘稠状或稠状或清液状等，有或无清香味或其它异味。
三、实验材料
1.菌种：灵芝（Tremella aurantialba）固体菌种。 2.材料：玉米粉、蛋白胨、葡萄糖。
3.其他：250mL三角瓶、量筒、聚丙烯塑料袋、线绳、剪刀等。 四、培养基配方
玉米粉1％，蛋白胨0.4％，葡萄糖2％ 五、菌种制作 1.拌料
按培养基组成要求称号原料，加入一定量的水。 2.装瓶
将配制好的培养液，分装在三角瓶内，一般 250mL三角瓶装 100 mL培养液，用 8 层纱布做成 8 cm 8 cm的瓶塞和牛皮纸或聚丙稀薄膜将口封好， 3.灭菌
将装有培养基的三角瓶置灭菌锅内，121℃灭菌0.5h，注意压力表和温度表的变化。灭菌结束后，缓慢放气，待瓶冷至80℃左右，将其搬入超净工作台内。 4.接种
（1）菌种表面消毒；
（2）将固体菌种捣碎，接种1－2勺到液体培养基中； （3）1瓶固体培养基可接5－7瓶液体培养基。 5.培养
接种后，置28℃恒温振荡培养箱中，150rpm正当培养2～3天。 6.观察
接种后，开始对原菌种生长情况进行观察，每天观察二次。 （1）记录菌丝萌发、生长、颜色、气味； （2）观察菌种是否被污染，被哪种微生物污染； （3）测量pH的变化 六、实验思考
1.影响液体摇瓶菌种质量的因素？
答：⑴培养基组成：培养基组成应能均衡地满足营养菌体生长对所有营养成分的需要。在这一前提下，培养基组成越丰富，所能获得的菌体浓就越高。如果由于某一必需营养成分不足而打破了这种均衡，那么其它营养成分的丰富不仅不能促进菌体的生长，反而因代谢的失衡引起pH的波动或毒性中间代谢产物的积累，而降低菌体浓度。 ⑵摇瓶装量：摇瓶装量影响摇瓶内的通气效果；装量越小，通气效果越好。 ⑶摇床转速：摇床转速越高，偏心距越大，摇瓶内的气体交换速度就越快。
⑷ 摇瓶在摇床中的位置：由于代谢热和机械振荡热的生成，摇床瓶内的温度必然高于摇床室室温。在摇床的不同位置，这种温差存在明显的差异。摇床上层的温度高于下层，中间
的温度高于边缘。由于这种差异，使在不同位置培养的摇瓶种子呈现不同的菌体生长浓度和生长阶段，造成种子质量的波动。为了避免这种波动，摇瓶种子的培养最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。
2.如何辨别培养液被细菌、霉菌污染？
答：将配制好的培养基放入普通培养箱，35±2℃，培养1-2天，若有菌生长的就是污染了。
3.使用超净工作台接种时，怎样确保菌种既不被污染也不被烫死？
答：在距酒精灯外焰10CM以内范围内进行接种的相关操作，可防止染菌。为避免被烫死，可稍离外焰远一点，但需在10CM无菌范围内。
4.使用固体麸皮菌种接种有何优点？
答：所需设备简单，工艺也较为易操作。另外，固体菌种接种在干燥的环境中，易于菌种的保存。
5.如何鉴定液体菌种的质量？
答：⑴观察菌液澄清度及颜色的变化：一般培养液前期菌液稍显浑浊，随着培养时间的延长，营养物质逐渐被利用，菌液就变得越来越澄清，污染细菌、放线菌、酵母菌的菌液则很浑浊；随着营养物被利用，溶液颜色也越来越淡，绝大多数呈淡黄色或橙黄色，但有些品种比较特殊，如：黑木耳呈青褐色，蜜环菌呈浅棕色。
⑵嗅菌液气味的变化：菌种培养前期，因菌液中含有大量单、多糖类营养物质，因而糖香味很浓，随着营养的被利用，菌液的糖香味越来越淡，取而代之的是或有或无的芳香气味。而染菌的培养液则散发出酸、甜、霉臭、酒精等各种异味。
⑶观察菌丝体（菌球）的浓度状态：菌种接入到菌液中24小时后，会发现接入的菌种颗粒周边萌发长出白色菌丝，当菌丝长到一定时期会断落到菌液中成为新的萌发点而产生新的菌球，到40-60小时之间，我们会发现菌液中有大量的菌丝片段。在60-80小时之间一般品种菌球达到最大的浓度（80-100%），取样后静置菌液基本不分层，料液的粘度高，菌丝(球)悬浮力好，菌球大小均匀、界线分明、活力强，而老化的菌种菌液颜色会逐渐变深，菌球轮廓不清，甚至自溶成为一体粘糊的粥状物。
⑷ 试管斜面培养基检查：液体菌种检验可分二次进行，第一次在培养24h—36h时取样，第二次在第培养36h—48h时取样。无菌条件下接入试管培养基中，塞上棉塞， 放入培养室或恒温培养箱内进行培养，温度为26℃—30℃ ，培养的24h—36h之间进行观察。如菌球萌发变洁白，接种面无红、黄、绿、黑色杂菌，证明液体菌种生长正常，液体菌种生长成熟，后即可使用接种；否则，菌球萌发不洁白，接种面出现红、黄、绿、黑色杂菌菌落，说明液体菌种已污染杂。
实验三 液体深层发酵
一、实验目的
1、了解机械搅拌发酵罐的基本结构 2、掌握机械搅拌发酵罐操作的基本步骤 二、实验原理
液体发酵技术是现代生物技术之一，起源于美国。它是指在生化反应器中，模仿自然界将生物体生长代谢所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供生物体生长代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行生物体大量培养繁殖，合成目的产物的过程。工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养。液体发酵技术与固体发酵技术相比具有菌种生产周期短、菌龄整齐一致、接种方便、适宜于工厂化生产等优点，因而受到了广泛的重视。 三、实验器材
1、菌种：灵芝液体摇瓶菌种10瓶
2、实验材料：麸皮、玉米粉、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、豆油 3、实验仪器：24L机械搅拌发酵罐、机械搅拌发酵罐控制柜、蒸汽发生器、空压机
四、培养基配方：
麸皮0.5％、玉米粉0.8％、葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、磷酸二氢钾0.06％、硫酸镁0.03％
五、机械搅拌发酵罐介绍
机械搅拌发酵罐通常包括：罐体、搅拌器和挡板、轴封和消泡装置、冷却装
置。
罐体：必须能承受一定压力和温度，通常耐受130℃和0.25MPa，径高比为1.7～3.5
搅拌器：作用混合和传质，即使通入的空气分散成气泡并与发酵液充分的混合，使气泡细碎以增大气液界面，获得所需要的溶氧速率，并使生物细胞悬浮分散与发酵体系中，维持气液固三项的混合与质量传递，同时强化传热过程。通常挡板直径是罐体直径的1/3～1/2.
挡板：防止液面中央形成漩涡流动，增强其湍流和溶氧传质，通常设4～6块挡板，挡板宽度是罐体直径的1/10 轴封：作用防止染菌和泄漏
其它：空气分布器、消泡装置。
实验室常用发酵装置
六、操作步骤
1、灭菌前的准备：
1) GJ-20C发酵罐是机电一体化的高科技设备，设备使用之前，应先检查电源是否正常，空压机、蒸汽发生器、循环水系统是否能正常工作。 2) 检查系统上的阀门、接头及紧固螺钉是否拧紧。
3) 开动空压机，用0.15Mpa压力，检查发酵罐、过滤器、管路、阀门的密封性能是否良好，有无泄漏。
4) 对温度仪、溶氧仪、pH仪、智控仪应根据使用说明书进行检查、校正。
2、空消
在投料前，气路、料路、发酵罐必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。
1) 空气管路的空消
(1) 空气管路上有除水减压阀，和除菌过滤器。除水减压阀不能用蒸汽灭菌，因此在空气管路通蒸汽前，必须将通向除水减压阀的阀门关死，使蒸汽通过蒸汽过滤器然后进入除菌过滤器。
(2) 空消过程中，除菌过滤器下端的排气阀应微微开启，排除冷凝水。 (3) 空消时间应持续40分钟左右，当设备初次使用或长期不用后启动时，最好采用间歇空消，即第一次空消后，暂定3～5小时再空消一次，以便消除芽孢。
(4) 经空消后的过滤器，应通气吹干，约20～30分钟，然后将气路阀门关闭。
2) 发酵罐空消
(1)发酵罐是将蒸汽直接通入罐内进行空消。
(2) 空消时，应将罐上的接种口，排气阀，及料路阀门微微打开，使蒸汽通过这些阀门排出，同时保持罐压为0.13～0.15Mpa。
(3) 空消时间为30～40分钟，特殊情况下，可采用间歇空消。 （4）空消结束后，应将罐内冷凝水排掉。
注意：1.发酵罐空消时，应将夹套内的水放掉，空消时最好将夹套排水阀打开，
以防夹套水排不净。
2.空消时，溶氧、pH电极应取出，可以延长其使用寿命。
3、实消
实消是当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌的过程。
1) 空消结束后，应尽快将配好的培养基从加料口加入罐内，此时夹套内应无冷却水。
2) 培养基在进罐之前，应先糊化，一般培养基的配方量以罐体全容积的70％左右计算(泡沫多的培养基为65％左右，泡沫少的培养基可达75～80％)，考虑到冷凝水和接种量因素，加水量约为罐体全容积的50％左右，即25升左右，加水量的多少与培养基温度和蒸汽压力等因素有关，需在实践中摸索。
3) 为了减少蒸汽冷凝水，实消先利用夹套通蒸汽对培养基进行预热，保持夹套压力≤0.15Mpa,待培养基温度到达90℃后，再同时向罐内通入蒸汽。打开蒸汽阀、进汽阀和排气阀，使蒸汽和空气同时进入培养基，当罐内温度升到90℃时，关闭进气阀和排气阀。罐温上升到105℃时，缓缓打开排汽阀，将罐顶冷空气排掉，持续五分钟后，关闭排气阀。
4) 当罐压升至0.12Mpa，温度升到121—123℃时，控制蒸汽阀门开度，保持罐压不变，30分钟后停止供汽。
5) 打开冷却水的进排阀门，在夹套内通水冷却。
注意：在夹套通水冷却时，罐压会急剧下降，当罐内压力降至0.05Mpa时，微微
开启排气阀和进气阀，开启电机进行通气搅拌，加速冷却速度，并保持罐压为0.05Mpa，直到罐温降至接种温度。 4、接种、培养
1) 本设备采用火焰封口接种，接种前应事先准备好酒精棉花、钳子、镊子和接种环。
2) 菌种装入三角烧瓶内，接种量10瓶。
3) 将酒精棉花围在接种口周围点燃，用钳子或铁棒拧开接种口，此时应向罐内通气，使接种口有空气排出。
4) 将三角瓶的菌种在火环中间倒入罐内。
5) 将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧。
6) 接种后即可通气培养，罐压保持在0.05Mpa。
7) 发酵温度根据工艺要求而定，通过调节循环水的温度来控制发酵温度，当环境温度高于发酵温度时，需用冷水降温。
8) 溶氧量的大小主要通过调节进气量来实现。
9) pH的调节是由控制系统通过执行机构（蠕动泵）自动加碱来实现。 10) 泡沫报警是由泡沫探头探测到泡沫液位信号在智控仪上以指示灯的形式来实现。
11) 在发酵中途要取样检查时，可通过取样口取样。取样前，取样管路阀门需用蒸汽灭菌，防止杂菌污染而引起误导，取样结束后同样要用蒸汽冲洗取样管道阀门。
注意：1.在打开水泵时，应检查水路阀门是否打开，以防烧毁水泵。
5、出料
1) 本设备的出料是利用罐压将发酵液从出料管道排出，根据发酵液的浓度，罐压可控制在0.05～0.1Mpa。
2) 出料后取出溶氧、pH电极，进行清洗保养。
3) 出料结束后，应立即放水清洗发酵罐及料路管道阀门，并开动空压机，向发酵罐供气搅拌，将管路中的发酵液冲洗干净。 七、液体菌种的检验方法
对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法。 1、感官检查 可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。
看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。
旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，
或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。
嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。
2、取样测验 可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等。 八、思考题：
1、机械搅拌发酵罐主要结构？
答：机械搅拌发酵罐主要部件包括罐体、搅拌器、轴封、消泡器、联轴器、中间轴承、空气吹泡管（或空气喷射器）、挡板、冷却装置、人孔、视镜以及管路等。
2、机械搅拌发酵系统的组成？
答：⑴罐体：罐体由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，小型发酵罐罐顶和罐身采用法兰连接，材料一般为不锈钢。
为了便于清洗，小型发酵罐顶设有清洗用的手孔。中大型发酵罐则装没有快开人孔及清洗用的快开手孔。 罐顶还装有视镜及灯镜。
在罐顶上的接管有：进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管。
在罐身上的接管有冷却水进出管、进空气管、取样管、温度计管和测控仪表接口。 ⑵搅拌器：搅拌器的作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于发酵液中。 ⑶挡板
挡板的作用是： ①防止液面中央产生漩涡， ②促使液体激烈翻动，增加溶解氧， ③改变液流的方向，由径向流改为轴向流。 ⑷消泡器
消泡器就是安装在发酵罐内转动轴的上部或安装在发酵罐排气系统上的，可将泡沫打破或将泡沫破碎分离成液态和气态两相的装置。从而达到消泡的目的。 ⑸联轴器
大型发酵罐搅拌轴较长，常分为二至三段，用联轴器使上下搅拌轴成牢固的刚性联接。 ⑹轴承
为了减少震动，中型发酵罐—般在罐内装有底轴承，而大型发酵罐装有中间轴承，底轴承和中间轴承的水平位置应能适当调节。 ⑺变速装置
试验罐采用无级变速装置。发酵罐常用的变速装置有三角皮带传动，圆柱或螺旋圆锥齿轮减速装置，其中以三角皮带变速传动较为简便。
⑻轴封
安装在旋转轴与设备之间的部件我们称之为轴封，轴封的作用：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止工作介质（液体、气体）沿转动轴伸出设备之处泄漏和污染杂菌。 ⑼发酵罐的换热装置：夹套式换热装置
3、如何对机械搅拌发酵系统进行消毒？
答：灭菌要进行空消和实消两步。空消是在投料前，对气路、料路、种子罐、发酵罐用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。实消是当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌的过程，种子罐和发酵罐实消的操作过程相同。
空消过程中，维持蒸汽温度121℃左右，先开排污水阀和进气阀，排空夹套水，在对管路、滤器和种子罐发酵罐灭菌，空消时间大约为30到40分钟，当设备初次使用或者长期不用的情况下，最好采用间歇灭菌的方法，间歇灭菌指第一次空消结束后，间隔3到5个小时再空消一次，以便杀死芽孢。除菌过滤器的滤芯不能承受高温高压，因此，蒸汽减压阀必须调整在0.13Mpa，不得超过0.15MPa。空消时，应将罐上的接种口、排气阀及料路阀门微微打开，使蒸汽通过这些阀门排出，同时保持罐压为0.13～0.15Mpa。空消结束后，应将罐内冷凝水排掉，并将排空阀门打开，防止冷却后罐内产生负压、损坏设备。空消时，溶氧、PH 电极取出，可以延长其使用寿命。
空消结束后，应尽快将配好的培养基从加料口加入罐内，此时夹套内应无冷却水。培养基在进罐之前，应先糊化，一般培养基的配方量以罐体全容积的70%左右计算(泡沫多的培养基为65% 左右，泡沫少的培养基可达75%～80%)，考虑到冷凝水和接种量因素，加水量为罐体全容积的50% 左右，加水量的多少与培养基温度和蒸汽压力等因素有关，需在实践中摸索。先开启机械搅拌装置，使罐内物料均匀混合，转速50～100rpm。打开夹套蒸汽阀、排汽阀，对罐内培养基预热，当罐内温度升到90℃时，关闭夹套进汽阀，打开罐内所有进汽阀，通入蒸汽。当罐温上升到105℃时，缓缓打开排汽阀，将罐顶冷空气排掉，持续五分钟后，关闭排汽阀。当罐压升至0.12Mpa，温度升到121～123℃时，控制蒸汽阀门开度，保持罐压不变，30 分钟后停止供汽。打开冷却水的进排阀门，在夹套内通水冷却，当罐内压力降至0.05Mpa 时，微微开启排气阀和进气阀，进行通气搅拌，加速冷却速度，并保持罐压为0.05Mpa，直到罐温降至接种温度。
4、发酵罐常用的接种方式？火焰接种要注意什么？
答：火圈接种；接种时操作应在火焰附近进行，接种时为避免菌种被烫死，取菌种后，应迅速将菌种至于火焰内焰接种到发酵罐中去。
5、发酵终点如何判断？
答：判断发酵终点有多种方法：
⑴从工艺指标来看，当温度开始下降，PH值不再变化时即是发酵终点。 ⑵用检验试剂进行滴定，测得发酵终点是比较科学的。
⑶在发酵液中加入石灰至PH12以上时加热至沸，澄清看其色号，色号越浅说明离发酵终点越近。
6、如何检查液体菌种的质量？
答：对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法。 ⑴、感官检查 可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。
看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。
旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。
嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。
⑵、取样测验 可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等。
实验四 生物活性成分分离纯化
一、实验目的：
1、掌握发酵液中活性成分提取的基本方法 2、了解大孔树脂提取活性成分的基本步骤 二、基本原理
根据树脂的表面性质，大孔吸附树脂可以分为非极性、中极性和极性三类，非极性吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合而成，不含任何功能基团，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适用于从极性溶剂(如水)中吸附非极性物质中；极性吸附树脂含有酯基，其表面兼有疏水和亲水部分，既可由极性溶剂中吸附非极性物质，也可以从非极性溶剂中吸附极性物质，极性树脂含有酰胺基、氰基、酚羟基等极性功能基，它们通过静电相互作用吸附极性物质根据树脂孔径、比表面积、树脂结构、极性差异，大孔吸附
树脂又分为许多类型，且分离效果受被分离物极性、分子体积、溶液值、洗脱液的种类等因素制约，在实际应用中，要根据分离要求加以选择。 三、实验材料 1、灵芝发酵液
2、AB-8大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）
3、其它：量筒、酒精、烧杯、层析柱（26×300mm）、蠕动泵、紫外检测仪 四、实验步骤
1、灵芝发酵液4000rpm、离心10分钟，取上清液备用 2、树脂柱预处理：
1）树脂装入交换柱后，用蒸留水反洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止，再用50%-100% 乙醇10-15倍体积慢速淋洗。
2）用约2倍体积的4-5%HCl溶液，以2 BV /h流速通过树脂层。全部通入后，浸泡4-8小时，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性。冲洗流速为10-20BV /h。
3）用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液，按上面进HCl的方法通入和浸泡。排去碱液，用洁净水冲洗至出水呈中性。流速同上。酸碱溶液若能重复进行2-3次，则效果更佳。经预处理后的树脂，在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量，以保证树脂获得充分的再生。
3、灵芝发酵液吸附与解析
1）3000 mL发酵液，用HCl调节pH2.5，3000 rpm离心30 min；
2）离心后发酵液经滤布过滤，滤液以4 mL/min流速上柱吸附；
3）吸附结束后，树脂倒入水中漂洗，同时注意把结团的树脂分散开，漂洗结束后树脂重新装柱，再用去离子水洗涤至无色。
4）然后分别用2000 mL 20%、40%、95% 乙醇和95%乙醇+2% NaOH以5%树脂体积/min流速洗涤，洗涤水和漂洗水合并浓缩定容至3000 mL，测定皂甙类物质含量。 4、树脂再生方法
1）酸性树脂用2.5倍树脂体积的HCl溶液（浓度4%）以2倍树脂体积60-80 min通完，然后用纯水的相同流速（慢速淋洗）30 min之后，加大流速（6BV/h）快速淋洗至出水pH至6-7为止。
2）碱性树脂方法同上，再生剂为4%NaOH溶液，尘洗终点为出水PH7-8。 3）中性树脂配制碱性盐水（含8%NaCl，2%NaOH），以用2.5倍树脂体积60-80 min通完，然后浸泡2-4小时，以纯水淋洗至出水PH呈中性。 五、思考题
1、大孔树脂吸附的主要原理？
答吸附原理：根据类似物吸附类似物的原则，一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。
2、大孔树脂预处理的主要目的？如何进行预处理？
答：预处理的目的：为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。
预处理的方法：乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h→水洗至中性，备用。
3、影响大孔树脂吸附的主要因素有哪些？
答：吸附树脂对有机物的去除效果与树脂本身的结构性质、吸附质的结构以及吸附处理过程中的操作条件有着密切的关系。 ⑴、大孔吸附树脂极性的影响
遵 从类似物吸附类似物的原则，根据吸附物质的极性大小选择不同类型的大孔吸附树脂。极性较大的化合物一般适用于在中极性的树脂上分离；极性小的化合物适用于 在非极性的树脂上分离。极性大小是一个相对概念，要根据分子中基团 (如羟基) 与非极性基团 (如烷基、苯环、环烷母核等) 的数量与大小来确定；对于未知化合物，可通过一定的预试验及TLC而大致确定。
⑵、大孔吸附树脂孔径的影响
大 孔吸附树脂是多孔性物质，其孔径特性可用比表面积 (S) 、孔体积 (V) 和计算所得的平均半径 (r) 来表征。假定孔道为圆柱形，则三者关系r=2V/S，V可由压汞仪测得，S可由比表面积测定仪测得。被分离成分通过树脂的孔道而扩散到树脂的内表面而被吸 附。大孔吸附树脂孔径的大小，直接影响不同大小的分子自由进入，从而使树脂具有选择性。因此，只有当孔径对于被分离成分足够大时，比表面积才能充分发挥作 用，即大孔吸附树脂比表面积越高，而平均孔径小。其吸附速度越慢，解吸越不够集中，杂质的分离效果也就越差。
⑶、大孔吸附树脂强度的影响
大孔吸附树脂强度与孔隙率有直接关系，也和制备工艺有关。这类树脂在酸碱中体积变化不大，在溶媒中则有一定程度的溶胀。一般大孔吸附树脂孔隙率越高，孔体积越大，则强度越差。大孔吸附树脂的强度直接影响树脂的使用寿命，从而影响着大孔吸附树脂法工艺的成本。
⑷、吸附流速的影响
对于同一浓度的上样溶液，吸附流速过大，树脂的吸附量就会降低。但吸附流速过小，吸附时间就会增加，在实际应用中，应综合考虑来确定最佳吸附流速，既要使大孔吸附树脂的吸附效果好，又要保证较高的工作效率。
⑸、温度的影响
物 理吸附和化学吸附都是放热过程，所以只要吸附已经达到平衡，增加温度无论是物理吸附量还是化学吸附量都会降低。但是由于化学吸附在低温时往往末达到平衡， 而升高温度会使吸附速度增快，所以对于化学吸附来说，在低温时常会出现吸附量随温度升高而增加的情况，直到真正达到平衡以后，吸附量才又随温度升高而下 降。 ⑹、其它组分存在时的影响
当溶液中存在二种以上溶质时，往往会引起一种溶质易吸附而使另一种溶质的吸附量降低，一般来讲，对混合溶质的吸附较纯溶质的吸附效果差。
4、影响大孔树脂解析的主要因素有哪些？
答：洗脱剂的种类、浓度、pH值、流速等都是影响解吸的因素。洗脱剂可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，应根据不同物质在树脂上吸附力的强弱选择不同的洗脱剂及浓度进行洗脱；通过改变洗脱剂的pH值可使吸附物改变分子形态，易于洗脱下来；洗脱流速一般控制在0.5～5m
固体基质发酵
一、实验目的：
1. 掌握固体基质发酵的工艺流程
2. 进一步熟练消毒灭菌技术和接种技术 二、实验原理：
固体底物基质固态发酵利用的培养基是既充当固相，又为微生物生长提供营养的初级农作物产物，如麸皮、马铃薯、谷子、豆饼以及其他含淀粉和纤维素的农作物产品。第二种固态发酵采用的固体是惰性载体，这些载体可以是天然的，也可以是人工分成的。这些载体材料有大麻、珍珠岩、聚氨酯泡沫体、蔗糖渣和聚苯乙烯等。
固体底物与一定比例的水充分混匀，装入容器中，灭菌，冷却至室温，接种在一定的温度下培养制得。 三、实验材料
1.菌种：金耳液体菌种
2.材料：麸皮，玉米粉，小麦等。
3.其他：碗状容器、量筒、剪刀、保鲜膜、电子天平、药匙等。 四、菌种制作 1.拌料
称量麸皮，玉米粉，小麦等装入塑料碗容器中，加适量水。 2.封口
用保鲜膜将碗口封好。 3.灭菌
将装有培养基的塑料碗置灭菌锅内，121℃灭菌1h，注意压力表和温度表的变化。灭菌结束后，缓慢放气，待冷至80℃左右，将其搬入超净工作台内。（灭菌1h作用：培养基是固体，要灭菌彻底：淀粉糊化） 4.接种
（1）用量筒量10ml金耳液体菌种，倒入碗内。
（2）用灭过菌的钥匙，将培养基和菌种搅拌均匀，培养基不宜太厚，尽量在容器中摊开。 5.培养
接种后，置28℃生化培养箱恒温培养。 6.观察
接种3d后，开始对原菌种生长情况进行观察，每天观察一次。 （1）记录菌丝萌发、生长、颜色；
（2）观察菌种是否被污染，被哪种微生物污染； 五、实验结果
实验五 实验室啤酒发酵
一、实验目的：了解啤酒发酵流程：啤酒发酵设备的结构、用途； 二、实验原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒） 三、实验器材
器材：粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、回旋沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器等；
菌种：啤酒生产用酵母菌株。 四、实验步骤：
步骤一、小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐空消
1、目的：熟悉啤酒酿造工艺流程，对发酵罐进行空消，为发酵做好准备。 2、原理：啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦汁过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程，啤酒发酵是纯种发酵，必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。
3、工艺流程介绍
啤酒发酵的工艺流程：
糖化煮沸锅，过滤槽、发酵罐的结构
4、实验步骤：
（1）熟悉各项设备； （2）清洗各项设备；
（3）将糖化煮沸锅加满水，夹套内通入蒸汽，将锅内水加热到100℃； （4）将热水分别打入回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中进行消毒； （5）待各项设备使用结束后，应及时进行清洗灭菌。 步骤二、麦芽汁的制备
1、目的：熟悉麦芽汁的制备流程，为啤酒发酵准备原料；
2、原理：麦汁制备包括原料糖化、麦汁过滤和麦汁煮沸的等几个过程，由于麦汁的价格相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，因此目前大多数工厂都用大米做辅料；
3、器材：在糖化车间一般有四种设备：糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅，本实验由于条件限制，只能采取单式设备，即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一。 4、步骤：
1）糖化用水量的计算 糖化用水量一般按下式计算:
W=A(100-B)/B
式中B过滤开始时的麦汁浓度（第一麦汁浓度）
A为100Kg原料中含有的可溶性物质（浸出物重量百分比） W为100Kg原料（麦芽粉）所需的糖化用水量（升） 2）糖化
糖化是利用麦芽中所含的酶，将麦芽和辅助原料的不溶性高分子物质，逐步分解为可溶性低分子物质的过程，制成的浸出物溶液就是麦芽汁。 传统的糖化方法主要有两大类：
（1）煮出糖化法：利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法。 （2）浸出糖化法：纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法。 本实验采用浸出糖化法，使用如下流程：
35~37℃，保温30分钟→50~52℃60分钟→65℃ 30分钟（至碘液反应完全） →76~78℃ 送入过滤槽 3）麦汁过滤
将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开，以得到澄清麦汁的过程。由于过滤槽底部是筛板，要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的，因此前30分钟的浸出物应返回重滤。头号麦汁滤完后，应用适量热水洗糟，得到洗涤麦汁。 4）麦汁煮沸
将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花（一
种含苦味和香味的蛇麻之花，每100升麦汁中添加约200克）。
煮沸的具体目的主要有：破坏酶的活性；使蛋白质沉淀；浓缩麦汁；浸出酒花成分；降低pH；蒸出恶味成分；杀死杂菌；形成一些还原物质。
添加酒花的目的主要有：赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味；增加啤酒的防腐能力；提高啤酒的非生物稳定性。
将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾，煮沸时间一般控制在1.5~2小时，蒸发量达15~20%（蒸发时尽量开口，煮沸结束时，为了防止空气中的杂菌进入，最好密封）。
5）回旋沉淀剂麦汁预冷却：
将煮沸后的麦汁从切线方向泵入回旋沉淀槽，使麦汁沿槽壁回旋而下，借以增大蒸发表面积，使麦汁快速冷却，同时由于离心力的作用，使麦汁中的絮凝物快速沉淀的过程。 6）麦汁冷却
将回旋沉淀后的预冷却麦汁通过薄板冷却器与冰水进行热交换，从而使麦汁冷却到发酵温度的过程。 7）设备清洗
由于麦芽汁营养丰富，各项设备及管阀件（包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器）使用完毕后，应及时用清洗液和清水洗涤，并蒸汽杀菌。
5、注意事项
1）若加热、煮沸过程中将蒸汽直接通入麦汁中，则由于蒸汽的冷凝，麦汁量会增加，因此最好用夹套加热的方法。
2）麦汁煮沸后的各步操作应尽可能无菌，特别是各管道就薄板冷却器应先进行杀菌处理。
步骤三、糖度的测定
1、目的：学习用糖锤度计测定糖度的方法。
2、原理：麦汁的好坏，将直接关系到啤酒的质量，工业上一般根据啤酒品种的不同来制造不同烈性的麦芽汁，因此及时分析麦芽汁的质量、调整麦芽汁制造工艺显得尤为重要。
为了调整啤酒酿制时的原麦汁浓度，控制发酵的进程，常常在麦汁过滤后、发酵过程中用简易的糖锤度计法测定麦汁的浓度。 3、器材：糖锤度计
4、步骤：取100mL麦汁或除气啤酒，放于100mL量筒中，放入糖锤度计，待稳定后，从糖锤度计与麦汁液面的交界处独处糖度，同时测定麦汁温度，根据校
准值，计算20℃时的麦汁糖度，若糖度较低，糖度计不能浮起来，可多加一些麦芽汁，直至糖度计浮在液体中。
步骤四、啤酒主发酵
1、目的：学习啤酒主发酵的过程，掌握酵母发酵规律。
2、原理：啤酒主发酵是静止培养的典型代表，是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，在一定温度下的培养过程，由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生产酒精，显然，同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体，因而前者降糖较快（所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时，所用液体培养基至少要1.5米深，才接近生产实际），定期摇动容器，既能增加溶氧，也能改善液体各成分的流动，最终加快菌种的生长过程。这种有酒精生产的静止培养比较容易进行，因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力，容许一定程度的粗放操作，由于培养基中糖的消耗，CO2与酒精的产生，比重不断下降，可用糖度表监视，若需分析其他指标，应从取样口取样测定。 3、器材：带冷却装置的发酵罐（100L）。 4、步骤：
将糖化后冷却至10℃左右的麦芽汁送入发酵罐，接入酵母菌种（实验四，共约5升），然后充氧，以利酵母菌生长，同时使酵母在麦芽汁中分散均匀（充氧即通入无菌空气，也可在麦汁冷却后进行，一般温度越低 ，氧在麦汁中的溶解度越大），待麦汁中的溶解氧饱和后，让酵母进入繁殖期，约20小时后，溶解氧被消耗，逐渐进入主发酵。 由于发酵密闭，很难看清发酵的整个过程，建议一个组在1000ml玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验，具体方法如下：
1）洗标本缸，缸口用8层纱布包扎后，进行高压灭菌；
2）将协定法糖化得到的麦汁，加水至600ml，再加葡萄糖是糖度达到10Bx，灭菌，冷却后摇动充氧，沉淀，将上清液一无菌操作方式倒入已灭菌的标本缸中。 3）将50ml酵母菌种接入，在10℃生化培养箱中发酵，每天观察发酵情况。 4）主发酵： 10摄氏度，7天至4.0 plato时结束（嫩啤酒）、一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期、起泡器，高泡器、落泡器和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别 。
附：发酵液的取样方法
若在发酵罐中发酵，可从取样开关处直接取样（先弃去少量发酵液）。
若无取样开关，可知一灭过菌的乳胶管，深入发酵液面下20cm处，用虹吸法使发酵液流出，弃去少量先流出的发酵液，然后用易清洁干燥的三角瓶接取发酵液作样品。
5、注意事项：除小数特殊的测定项目外，应将发酵液在两干净的大烧杯中来回倾倒50次以上，以除去co2，再经过滤后，滤液用于分析、分析工作应尽快完成。
步骤五、后发酵
1、目的：了解啤酒后发酵的工艺操作特点。
2、原理：主发酵结束后的啤酒尚未成熟，称为嫩啤酒，必须经过后发酵过程才
能饮用，后发酵在0℃~2℃下利用酵母菌本身的特性去除嫩啤酒的异味，使啤酒成熟。 3、步骤
当发酵罐中的糖度下降至4.0~4.5BX时，开始封罐，并将发酵温度降至2℃左右，8~12天后，罐压升至0.1Mpa，说明已有较多co2产生并溶于酒中，即可饮用。若用酿制更加可口的啤酒，后发酵温度应降低，时间应延长。 如果没有后发酵罐，可用下述办法处理。 1）选取耐压瓶子，清洗，消毒灭菌。
2）将嫩啤酒虹吸灌入，装量约为容积的90%，注意不要进入太多氧气。 3)盖紧盖子,放于0~2℃冰箱中后发酵3个月。 4、注意事项
1）因后酵会产生大量气体，不能选用不耐压的玻璃瓶，以免危险。
2）不要吸入太多氧气，瓶子上段不要留有太多空气，否则啤酒会严重氧化味。
五、作业要求
1.了解啤酒发酵设备的组成，各个设备的用途；
答：粉碎机：粉碎麦芽。
糖化煮沸锅：使淀粉质原料糖化、糊化。
过滤沉淀槽：将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开，以得到澄清麦汁
回旋沉淀槽：麦汁沿槽壁回旋而下，借以增大蒸发表面积，使麦汁快速冷却，同时由于
离心力的作用，使麦汁中的絮凝物快速沉淀。
发酵罐：用于啤酒发酵。
制冷机：提供低温的冰盐水。
板式换热器：实现麦汁与冰盐水的热量交换。
2.了解啤酒发酵流程；
答：麦芽粉碎 糊化 煮沸 回旋沉淀 冷却 发酵 过滤 包装 分销
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