酒精发酵实验

酵母菌酒精发酵的条件研究

一、实验目的

1.了解酒精发酵的主要类型及其控制条件。 2.熟悉酒母的培养方法。

3.掌握酒精发酵的操作方法。 二、实验原理

在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并放出二氧化碳的作用，成为酒精发酵作用。酒精发酵的类型有三种：1、通过EMP途径的酵母菌酒精发酵；2、通过HMP途径的细菌酒精发酵；3、通过ED途径的细菌酒精发酵。在工业酒精和各种酒类的生产中，酒精发酵作用主要是由酵母菌完成的，因此酵母菌的酒精发酵作用是它们的工艺基础。

酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下，丙酮酸继续分解为乙醇。但是如果在碱性条件或培养基中加有亚硫酸盐时，产物就主要是甘油，这也就是工业上的甘油发酵。因此，如果酵母菌要进行酒精发酵，就必须控制发酵液在微酸性条件。 三、实验材料

3.1 试剂：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种，红糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、黄豆芽、葡萄糖、琼脂、蒸馏水、无菌水。

仪器：铝锅、电炉、电子天平、摇床、水浴锅、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、UV-754 紫外可见分光光度计。 3.2 培养基配方

1、固体斜面培养基。豆芽汁葡萄糖培养基的配制：黄豆芽10g、葡萄糖5g、琼脂1.5~2g、水100ml，pH自然

2、液态发酵培养基。红糖100g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾1.0g，自来水1000ml,pH自然。配好后的发酵培养基分装入250ml三角瓶中，每瓶100ml，湿热灭菌30min。 四、实验方案 4.1 菌种活化

把实验室保存的菌种在无菌室接种于固体斜面培养基中，于恒温箱37℃，培养2~3d，取出生长状况较好、齿状清晰的斜面为下一步接种的对象。 4.2 种子培养

挑取菌种，接种于液体种子培养基中，种子液装液量为100ml，摇床培养37℃,24h，120r/min，对比培养24h的种子培养液，选取液体较为浑浊的接种对象。

4.3 发酵培养

把选中的种子液用移液管按发酵液100ml10%的比例接种，恒温培养24h。 4.4 发酵条件优化

单因素试验。影响酵母菌酒精发酵的主要因素有C源浓度、N源浓度、pH、培养温度等，分别对这些影响因素进行单因素试验。

正交试验。在单因素实验的基础上进行正交试验，对酵母菌酒精发酵的条件进行优化，具体设计见下表。 水平 C源浓度硫酸铵浓度pH（C） 培养温度因素 （A） （B）/% /℃

1 2 3

45 50 55 1.0 1.5 2.0 5.5 6.0 6.5 28 30 32 3.5发酵产品鉴别与测定

1、打开瓶盖，嗅有无酒精味。2、看是否有气泡。3、取发酵液5ml加入试管，加10%的硫酸2ml，滴入1%的铬酸钾溶液10~20滴，如管内由橙色变成黄色，证明有酒精生成。4、酒精量的测定：重铬酸钾法

1、仪器与试剂(1)UV-754紫外可见分光光度计。(2)电热恒温水浴箱。(3)乙醇标准溶液：称取优级纯无水乙醇0.2000g于100ml容量瓶中，加水至刻度。此溶液每毫升相当于2.0mg乙醇。(4)5%重铬酸钾溶液：称取5g重铬酸钾(AR)溶于50ml水中，加10ml浓硫酸，放冷，加水至100ml。(5)试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2、试验方法取两支刻度一致的10ml比色管,一支加入适量乙醇标准工作液,一支不加,分别加入重铬酸钾溶液2.0ml,加水至刻度。在100℃水浴中加热10min,取出用流水冷却5min,以零管作参比,用1cm比色皿,于波长600nm处测定吸光度,以乙醇浓度与对应的吸光度A的作工作曲线。

3、结果计算根据样品溶液的吸光值,查工作曲线得样品含量M,换算成20℃酒精度X按下式计算:酒精度(度)X=M×10-3×100/(V 0×V/100×0.79)

式中X:100ml溶液中所含乙醇的体积数(度)；M:由标准曲线所查得样品含量(mg)；V 0:取酒样体积,(ml)；V:所取样品稀释液的体积(ml)；0.79:20℃时乙醇密度(g/ml)。 五、实验结果

5.1 改变碳源浓度对产酒精量的影响

改变碳源浓度进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于30℃静置培养24h后测酒精含量，结果如下图。

5.2 改变氮源浓度对产酒精量的影响

改变氮源浓度进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于30℃静置培养24h后测酒精含量，结果如下图。 5.3 改变pH对产酒精量的影响

改变pH进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于30℃静置培养24h后测酒精含量，结果如下图。

5.4 改变温度对产酒精量的影响

改变温度进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于28℃、30℃、32℃静置培养24h后测酒精含量，结果如下图。 5.5 正交实验结果

根据正交实验表的设计方案，改变发酵培养基的组成和培养条件，接种10%的液态种子，摇匀后静置培养24h后测酒精含量，结果见下表