实验六 肠杆菌科细菌的微生物学鉴定

实验六 肠杆菌科细菌的微生物学鉴定

课程名称：兽医微生物学

实验学时： 6学时

一、目的要求

1．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌形态与染色特性以及主要培养特性； 2．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌常规微生物学诊断法； 3．掌握大肠杆菌和沙门氏菌生化试验的方法和原理；

4．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌在选择性和鉴别培养基上的生长表现； 5．熟悉沙门氏菌血清分群、定型的方法和步骤。

二、知识背景

肠杆菌科的细菌为革兰氏阴性、中等大小的杆菌，运动者周身鞭毛；在普通培养基上生长好；发酵葡萄糖和碳水化合物者产酸或产酸产气；在麦康凯琼脂上生长；细胞色素氧化酶阴性；还原硝酸盐为亚硝酸盐等。碳水化合物的利用和其它生化试验是肠杆菌科细菌鉴定的重要试验。

大肠埃希氏菌（E.coli）简称大肠杆菌，作为原发和继发病原可引起多种动物疾病：犊牛的肠道感染和水泻；幼猪的水泻和腹泻，二月龄以上猪的出血性肠炎和水肿病；狗的尿道感染；鸡的气囊炎和大肠杆菌肉芽肿（Coligranuloma）。

沙门氏菌（Salmonella），虽然沙门氏菌血清型超过2200个，但承认的种为数不多，在O抗原的基础上，沙门氏菌血清组（群）用字母A、B、C…表示，然后根据它的H抗原（鞭毛抗原）再分，用阿拉伯数字1、2、3…等表示，沙门氏菌可引起多种动物和人的疾病，是肠杆菌科重要的致病菌，如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）可引起动物流产，胃肠炎和败血症。

其它肠杆菌科成员：肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）可引起牛乳房炎、肺炎、母马的宫颈炎和子宫炎，这个菌常形成厚的荚膜。变形杆菌（proteus）引起动物的尿道和胃肠道疾病。耶尔森氏菌（yersinia）引起鼠疫、胃肠炎等。

生化试验和血清群的鉴定和定型在肠杆菌科细菌的鉴定中占很重要的位置。

三、实验材料

每6人一组，每组所需材料：

1．普通琼脂斜面培养物2管：分别为大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌（提供实验用菌种）； 2．普通肉汤2管：分别用来接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌； 3．普通琼脂平板2个分别用来划线接种大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌；

4．生化试验用培养基2套，包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验管、靛基质，M．R、V．P试验、柠檬酸盐利用，硝酸盐还原试验等； 5．三糖铁琼脂斜面培养基2管；

6．选择性培养基2个，如：麦康凯琼脂平板或远滕氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板； 7．各种生化试验试剂：靛基质试剂，M．R试剂，V．P试剂，硝酸盐还原试剂； 8．沙门氏菌因子血清。

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四、操作程序

1．观察大肠杆菌和沙门氏菌在琼脂平板上的菌落特征并作描述； 2．观察大肠杆菌和沙门氏菌肉汤培养物，注意生长表现；

3．从两种菌琼脂平板上挑取菌落涂片作革兰氏染色，注意菌体形态特征和染色特性；

4．用两种菌琼脂斜面培养物分别接种生化试验用的各种培养基以及三糖铁琼脂斜面（先斜面划线再穿刺

接种）；

5．用两种菌肉汤培养物在鉴别性培养基平板划线，分别用其1/2面积；

6．将接种的试管和平板以组为单位放人37℃培养箱中培养24-48小时，观察结果； 7．检查并记录大肠杆菌和沙门氏菌糖发酵试验结果及在三糖铁琼脂斜面/底部的生长表现； 8．观察大肠杆菌和沙门氏菌在麦康凯琼脂平板上的菌落表现； 9．沙门氏菌血清群和型的鉴定。

（1）分群：取一张洁净玻片，取2满环沙门氏菌多价O血清（A—E群）至玻片上，再用接种环挑取疑为

沙门氏菌的纯培养物少许，与玻片上的多价O血清混匀，再稍动玻片，若在2min内出现凝集现象，即可初步确定该菌为沙门氏菌：同样用生理盐水代替多价血清作一对照，以免由于细菌的自凝而判断错误。再用代表A群（O2）、B群（O4）、C1群（O7）、C2群（O8）、D群（O9）与E群（O3）的O因子血清作同样的玻片凝集反应，视其被哪一群O因子血清所凝集，则确定被检沙门氏菌为该群。

（2）定型：菌群决定后，用该群所含的各种O因子血清和被检菌作玻片凝集反应，以确定其含哪些O抗

原。同样，用该群H因子血清与被检菌作玻片凝集反应、以确定其H抗原。根据检出的O抗原和H抗原列出被检菌的抗原式，查对沙门氏菌的抗原表即可知被检菌为哪种沙门氏菌，譬如某一菌的O抗原为O1、4、5、12，而H抗原为i：1,2，其抗原结构式为1,4,5,12:i:1,2，查知这个菌为鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimuium）。

一般情况下，如不要求定型，只做到定群这一步即可。在实际工作中，判定被检菌是否为沙门氏菌，应根据被检菌的生化反应和血清学诊断结果结合起来考虑。凡两者均符合沙门氏菌特性，即确认为沙门氏菌，凡两者中有一项符合沙门氏菌特性者，则可认为是沙门氏菌。

本实验中大肠杆菌与沙门氏菌的区别

实验细菌 三糖铁琼脂斜面 斜面/底部H2S产生 黄/黄 不产生 葡萄糖糖发酵 M.R乳糖麦芽糖蔗糖V.P靛基质 枸橼酸盐利用 运动力大肠杆菌 ⊕ ⊕ ⊕ － ⊕ ⊕ ⊕ － + －－+ － + 沙门氏菌 红/黄 产生 + － + + 兽医微生物实验指导 成大荣 20

肠杆菌科细菌检验程序示意图

被 检 材 料 37℃增菌18—24h划 线 分 离 麦康凯琼脂平板或其他选择性培养基挑取特征性菌落涂片、染色、镜检移 植 普通肉汤管 普通琼脂斜面37℃，24h观察结果： （1）三糖铁斜面与底部的变化，可说明是沙门氏菌或是大肠杆菌； （2）普通肉汤管培养物，涂片、染色、镜检，证实其菌体形态和染色性的一致性（纯度）；（3）普通琼脂斜面培养物 三糖铁琼脂斜面 生 化 试 验 血清型鉴定 根据生化试验和血清型鉴定结果确认为何种菌 五、细菌特性描述

菌种

菌 落： 革兰氏染色： 菌体形态： 运 动 性：

葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖

M.R V.P 枸橼酸盐利用 靛基质

生化试验

三糖铁琼脂斜面（斜面/底部）的变化： 菌 落：。 革兰氏染色：。 菌体形态： 运 动 性：。

葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖

糖发酵

M.R V.P 枸橼酸盐利用 靛基质

生化试验

三糖铁琼脂斜面（斜面/底部）的变化：

糖发酵

描述其主要生物学特性与生化特性

大肠杆菌 （E.coli）

沙门氏菌 （S.typhimurium）

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六、问题分析

1、 比较大肠杆菌与沙门氏菌形态、染色特征以及在普通肉汤和普通琼脂培养基上的生长表现。 2、 大肠杆菌与沙门氏菌主要生化性质有哪些不同？ 3、 对本试验中的几种生化实验的原理？

4、 血清型的分群和定型在肠杆菌科细菌鉴定上有何重要性？

5、 大肠杆菌与沙门氏菌在三糖铁琼脂斜面与底部生长表现有何不同？简述原理。

七、成绩评定

1．能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%。 2．动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%。 3．报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩 30%。 4．讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。