一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111060373 A(43)申请公布日 2020.04.24

(21)申请号 201911334720.0(22)申请日 2019.12.23

(71)申请人 苏州堪赛尔医学检验有限公司

地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖

街218号生物纳米园B1楼306单元(72)发明人 王守立　赵飞　沈刚　

(74)专利代理机构 苏州隆恒知识产权代理事务

所(普通合伙) 32366

代理人 周子轶(51)Int.Cl.

G01N 1/30(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页

(54)发明名称

一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法(57)摘要

本发明公开了一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法，组织脱钙液的制备方法，包括以下步骤：将40～60份甲酸、3～5份乙酸以及140～180份10％福尔马林混合均匀得到a液；将38～44份多聚甲醛、36～42份植物源性有机酸以及800～900份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得所述组织脱钙液。组织脱钙方法包括以下步骤：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，进行微波辐射脱钙；将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。本发明组织脱钙液及其制备方法、应用方法，其24h即可完成脱钙处理，脱钙速率较快，并且脱钙处理的效果较好，能使骨组织完全脱钙。

CN 111060373 ACN 111060373 A

权　利　要　求　书

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1.一种组织脱钙液，其特征在于，以重量份计，包括以下成分：多聚甲醛38～44份、甲酸40～60份、乙酸3～5份、

植物源性有机酸36～42份、10％福尔马林140～180份、水800～900份。

2.根据权利要求1所述的组织脱钙液，其特征在于，所述植物源性有机酸的制备方法包括如下步骤：

步骤一：将溪黄草洗净并干燥，将干燥后的溪黄草粉碎成100目的粉末状，然后干燥至恒重；

步骤二：取步骤一中干燥至恒重的溪黄草粉末与60wt％～80wt％的乙醇混合均匀，然后水浴加热，回流提取3次，合并提取液；

步骤三：将步骤二中的提取液减压浓缩至体积减半，再调节pH至11.0得到碱水液，用乙酸乙酯萃取5次，去除乙酸乙酯，留下萃取后的碱水液，再将碱水液pH调节至2.5，用乙酸乙酯再次萃取5次，收集乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯，将剩余物真空干燥即得所述植物源性有机酸。

3.根据权利要求2所述的组织脱钙液，其特征在于，所述植物源性有机酸的制备方法步骤二中溪黄草粉末与乙醇按照料液比1:(10～15)混合。

4.根据权利要求2所述的组织脱钙液，其特征在于，所述植物源性有机酸的制备方法步骤二中水浴加热的温度为80～90℃，回流提取时每次提取的时间为2～3h。

5.一种组织脱钙液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将40～60份甲酸、3～5份乙酸以及140～180份10％福尔马林混合均匀得到a液；将38～44份多聚甲醛、36～42份植物源性有机酸以及800～900份水混合均匀得到b液；将所述a液和所述b液混合均匀即得所述组织脱钙液。6.一种组织脱钙方法，其采用如权利要求1所述的组织脱钙液，其特征在于，所述组织脱钙方法包括以下步骤：

步骤一、将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，进行微波辐射脱钙；

步骤二、将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。

7.根据权利要求6所述的组织脱钙方法，其特征在于，步骤一中微波辐射脱钙的工艺为：将装有骨组织标本和组织脱钙液的密闭容器置于微波炉内60℃～70℃辐射30s，取出置于室温下冷却15～20min，如此反复6～8次后，再静置24h即可。

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说　明　书

一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法

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技术领域

[0001]本发明涉及了生物技术领域，具体的是一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法。背景技术[0002]病理实验制作切片时，经常碰到一些含钙组织，而且钙十分坚硬。由于组织中的钙和石蜡之间的密度不同，含钙的组织一般不能直接制作切片，而是需要经过脱钙处理，再进行切片。脱钙是组织切片的重要环节。[0003]对组织脱钙时，需要达到充分脱钙，但同时也需要保护组织不受到较严重的破坏。现有的组织脱钙液，多使用一些强有机酸，或是盐酸、硝酸等无机酸，这些酸可以在短时间内除去大量的钙，但同时对组织形态的破坏性较强，尤其是对于一些细小组织，根本不适用。

[0004]因此，有必要针对现有技术中的组织脱钙液做出进一步的改进，以在保持较好脱钙性能的同时能够降低其对组织的破坏性。

发明内容

[0005]为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种组织脱钙液及其制备方法、应用方法，其24h即可完成脱钙处理，脱钙速率较快，并且脱钙处理的效果较好，能使骨组织完全脱钙。脱钙处理后的骨组织切片完整、无明显刀痕，且HE染色核质清晰、胞浆鲜艳。[0006]本发明公开了一种组织脱钙液，以重量份计，包括以下成分：[0007]多聚甲醛38～44份、[0008]甲酸40～60份、[0009]乙酸3～5份、

[0010]植物源性有机酸36～42份、[0011]10％福尔马林140～180份、[0012]水800～900份。[0013]作为优选，所述植物源性有机酸的制备方法包括如下步骤：[0014]步骤一：将溪黄草洗净并干燥，将干燥后的溪黄草粉碎成100目的粉末状，然后干燥至恒重；

[0015]步骤二：取步骤一中干燥至恒重的溪黄草粉末与60wt％～80wt％的乙醇混合均匀，然后水浴加热，回流提取3次，合并提取液；[0016]步骤三：将步骤二中的提取液减压浓缩至体积减半，再调节pH至11.0得到碱水液，用乙酸乙酯萃取5次，去除乙酸乙酯，留下萃取后的碱水液，再将碱水液pH调节至2.5，用乙酸乙酯再次萃取5次，收集乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯，将剩余物真空干燥即得所述植物源性有机酸。[0017]进一步优选，所述植物源性有机酸的制备方法步骤二中溪黄草粉末与乙醇按照料液比1:(10～15)混合。

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进一步优选，所述植物源性有机酸的制备方法步骤二中水浴加热的温度为80～90

℃，回流提取时每次提取的时间为2～3h。

[0019]本发明还公开了一种组织脱钙液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0020]将40～60份甲酸、3～5份乙酸以及140～180份10％福尔马林混合均匀得到a液；[0021]将38～44份多聚甲醛、36～42份植物源性有机酸以及800～900份水混合均匀得到b液；

[0022]将所述a液和所述b液混合均匀即得所述组织脱钙液。[0023]本发明同时公开了一种组织脱钙方法，所述组织脱钙方法包括以下步骤：[0024]步骤一、将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，进行微波辐射脱钙；[0025]步骤二、将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0026]作为优选，步骤一中微波辐射脱钙的工艺为：将装有骨组织标本和组织脱钙液的密闭容器置于微波炉内60℃～70℃辐射30s，取出置于室温下冷却15～20min，如此反复6～8次后，再静置24h即可。

[0027]本发明的有益效果如下：

[0028]采用本发明中的组织脱钙液以及组织脱钙处理方法，24h即可完成脱钙处理，脱钙速率较快，并且脱钙处理的效果较好，能使骨组织完全脱钙。脱钙处理后的骨组织切片完整、无明显刀痕。且HE染色核质清晰、胞浆鲜艳。[0029]在脱钙处理中，本发明制备了植物源性有机酸，该植物源性有机酸的酸性比现有脱钙液中常用的有机酸的酸性弱，与本发明中甲酸等有机酸复配后，可以缓解脱钙处理对组织形态产生的不良影响，防止脱钙处理对组织产生较大的破坏性。并且该植物源性有机酸同时能够促进骨组织脱钙。

[0030]为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。

具体实施方式

[0031]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032]实施例1～5和对比例中所用的水均为蒸馏水。

[0033]实施例1～5中的植物源性有机酸的制备方法包括如下步骤：[0034]步骤一：将溪黄草洗净并干燥，将干燥后的溪黄草粉碎成100目的粉末状，然后干燥至恒重；

[0035]步骤二：取步骤一中干燥至恒重的溪黄草粉末与70wt％的乙醇按照料液比1:12混合均匀，然后85℃水浴加热，回流提取3次，每次提取的时间为2.5h，合并提取液；[0036]步骤三：将步骤二中的提取液减压浓缩至体积减半，再用碳酸钠调节pH至11.0得到碱水液，用乙酸乙酯萃取5次，去除乙酸乙酯，留下萃取后的碱水液，再用盐酸将碱水液pH

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调节至2.5，用乙酸乙酯再次萃取5次，收集乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯，将剩余物真空干燥即得所述植物源性有机酸。[0037]实施例1[0038]制备组织脱钙液：将60份甲酸、3份乙酸以及180份10％福尔马林混合均匀得到a液；将38份多聚甲醛、42份植物源性有机酸以及800份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0039]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先70℃辐射30s，取出置于室温下冷却15～20min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0040]实施例2[0041]制备组织脱钙液：将40份甲酸、5份乙酸以及140份10％福尔马林混合均匀得到a液；将44份多聚甲醛、36份植物源性有机酸以及900份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0042]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先60℃辐射30s，取出置于室温下冷却18min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0043]实施例3[0044]制备组织脱钙液：将55份甲酸、3.5份乙酸以及170份10％福尔马林混合均匀得到a液；将40份多聚甲醛、40份植物源性有机酸以及840份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0045]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先65℃辐射30s，取出置于室温下冷却18min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0046]实施例4[0047]制备组织脱钙液：将45份甲酸、4.5份乙酸以及150份10％福尔马林混合均匀得到a液；将42份多聚甲醛、38份植物源性有机酸以及860份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0048]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先65℃辐射30s，取出置于室温下冷却18min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0049]实施例5[0050]制备组织脱钙液：将50份甲酸、4份乙酸以及160份10％福尔马林混合均匀得到a液；将41份多聚甲醛、39份植物源性有机酸以及850份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0051]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标

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本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先65℃辐射30s，取出置于室温下冷却18min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0052]对比例1

[0053]本对比例与实施例5的区别在于不添加植物源性有机酸。具体如下：[0054]制备组织脱钙液：将50份甲酸、4份乙酸以及160份10％福尔马林混合均匀得到a液；将41份多聚甲醛以及850份水混合均匀得到b液；将a液和b液混合均匀即得组织脱钙液。[0055]组织脱钙处理：将骨组织切为1.5cm×1.0cm×0.3cm的骨组织标本，再将骨组织标本置于装有组织脱钙液的密闭容器中，将该密闭容器置于微波炉内进行微波辐射脱钙，先65℃辐射30s，取出置于室温下冷却18min，如此反复7次再静置24h即可。将微波辐射脱钙后的骨组织标本取出用流水清洗30min，然后进行脱水、包埋、切片和染色。[0056]将实施例1～5以及对比例1中脱钙后的组织进行性能测定。采用针刺法对脱钙处理后的骨组织的脱钙程度进行判断。测试结果见下表：

[0057]

 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5对比例1

切片效果

切片完整，少量刀痕切片完整，少量刀痕切片完整、无明显刀痕切片完整、无明显刀痕切片完整、无明显刀痕切片不完整，明显刀痕

染色效果HE染色核质清晰HE染色核质清晰HE染色核质清晰

HE染色核质清晰、胞浆鲜艳HE染色核质清晰、胞浆鲜艳HE染色核质不够清晰、胞浆太红

脱钙效果

脱钙较完全，少量残留脱钙较完全，少量残留脱钙较完全，少量残留脱钙完全脱钙完全

脱钙不完全，大量残留

由测试结果可知，实施例5是本发明中最佳实施方案。[0059]采用本发明中的组织脱钙液以及组织脱钙处理方法，24h即可完成脱钙处理，并且脱钙处理的效果较好，能使骨组织完全脱钙。脱钙处理后的骨组织切片完整、无明显刀痕。在染色后HE染色核质清晰、胞浆鲜艳。[0060]在脱钙处理中，本发明制备了植物源性有机酸，该植物源性有机酸的酸性比现有脱钙液中常用的有机酸的酸性弱，与本发明中甲酸等有机酸复配后，可以缓解脱钙处理对组织形态产生的不良影响，防止脱钙处理对组织产生较大的破坏性。并且该植物源性有机酸同时能够促进骨组织脱钙。

[0061]对比例1中未采用本发明制备的植物源性有机酸，其处理效果较差。可见，本发明中植物源性有机酸对骨组织的脱钙处理具有很好的作用。

[0062]本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

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